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PML-RARα与hGM-CSF/hIL-2基因的真核双表达载体构建和表达研究

作　者: 胡刚
导　师: 李扬秋
学　校: 暨南大学
专　业: 内科学
关键词: 急性早幼粒细胞白血病 PML-RARα hGM-CSF hIL-2 DNA疫苗
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 79次
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内容摘要


目的：构建PML-RARα与hGM-CSF／hIL-2基因的真核双表达载体，检测该双表达载体在真核细胞中的蛋白表达情况，为治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia，APL）的DNA疫苗研究奠定基础。方法：利用RT-PCR技术从NB4细胞中扩增出PML-RARα基因片段，并将其克隆到pIRES真核双表达载体的多克隆位点A（MCS A）中，构建pIRES-PML-RARα质粒。利用PCR技术和RT-PCR技术获取hGM-CSF和hIL-2基因，并将它们分别克隆到pIRES-PML-RARα质粒的多克隆位点B（MCS B）中构建pIRES-PML-RARα-hGM-CSF和pIRES-PML-RARα-hIL-2真核双表达质粒。将测序正确的重组质粒利用LipofectamineTM 2000转染K562细胞或A549细胞，通过RT-PCR和Realtime-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况，利用点杂交、ELISA和SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果：成功构建了pIRES-PML-RARα、pIRES-PML-RARα-hGM-CSF和pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒，并且测序正确。RT-PCR和Realtime-PCR鉴定表明转染K562细胞和A549细胞后这些质粒能够在真核细胞中进行转录。点杂交和ELISA结果显示重组质粒在真核细胞中可表达hGM-CSF或hIL-2蛋白，SDS-PAGE结果在预期位置亦可见到PML-RARα蛋白条带。结论：本研究将PML-RARα与hGM-CSF／hIL-2组合，成功构建了pIRES-PML-RARα以及pIRES-PML-RARα-hGM-CSF／pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒，这些重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML-RARα和hGM-CSF／hIL-2蛋白。

全文目录


中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
目录  6-7
一 前言  7-21
  1 PML-RARα融合基因  7-8
  2 白血病疫苗  8-15
  3 DNA疫苗免疫增强效应研究进展  15-20
  4 存在问题  20
  5 研究目的和内容  20-21
二 材料和方法  21-42
  1 主要实验仪器及设备  21-22
  2 主要实验材料和试剂  22-27
  3 技术路线  27-28
  4 实验方法  28-30
  5 实验步骤  30-42
三 结果  42-58
  1 pIRES-PML-RARα重组质粒的构建  42-45
  2 pIRES-PML-RARα-GM-CSF重组质粒的构建  45-48
  3 pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建  48-51
  4 pIRES-PML-RARα-GM-CSF重组质粒体外表达检测  51-54
  5 pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒体外表达检测  54-58
四 讨论  58-63
  1 pIRES-PML-RARα重组质粒的构建  58-59
  2 用于增强PML-RARα融合基因DNA疫苗的细胞因子佐剂的选择  59-61
  3 重组载体的体内外表达的检测  61
  4 实验方法探讨  61-62
  5 存在问题和进一步的实验设想  62-63
结论  63-64
参考文献  64-69
附录一 英文缩略词表  69-71
附录二 各种重组质粒的构建流程图  71-73
附录三 已经构建成功并且测序正确的质粒图  73-74
附录四 各种重组质粒的测序结果图  74-78
附录五 在校期间发表论文情况  78-79
致谢  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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