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冰片开放血脑屏障及通过P糖蛋白介导的机制研究

作　者: 朱国栋
导　师: 刘国龙
学　校: 广州医学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 血脑屏障冰片 P-糖蛋白荧光显微镜荧光分光光度法免疫组化法高效液相色谱法
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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引　用: 6次
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内容摘要

背景:血脑屏障(blood - brain barrier ,BBB)是中枢神经系统和血液的分界面,保护脑组织的内环境不受血液成分的改变而突变,但同时也限制了治疗性药物的颅内浓度。近年来颅内肿瘤的发病率逐年增高,常规的化疗药物如脂溶性的烷化剂及混合性的亚硝胺类都难以达到理想的治疗浓度,即便是最新一代的烷化剂—替莫唑胺在中枢神经系统的浓度也只有血液的40%,水溶性化疗药物的通透性则更差,因此寻找有效提高化疗药物血脑屏障通透性的方法,成为了目前国内外研究的热点。中药以其高效低毒的特性备受关注,现代研究中发现冰片作为小分子脂溶性单萜类物质,口服后不但能迅速透过血脑屏障,而且还能打开血脑屏障促使其他药物通过,发挥引药之用,但目前多数是单一药物的定性研究,结果差异较大,也没有揭示冰片开放血脑屏障的时效量效关系。因此精确检测冰片在动物体内开放血脑屏障的时效量效关系,就其“芳香走窜,引药上行”的可能机理进行探索,为其将来的临床应用提供实验依据,具有重要意义。目的:研究芳香开窍类中药冰片对血脑屏障(BBB)的促透作用,动态定量检测冰片促药物透过血脑屏障的时效、量效关系,探讨冰片通过P糖蛋白(p-gp)介导血脑屏障开放的可能作用机制。方法:1、制作大鼠脑组织快速冰冻切片,应用荧光显微镜定性观察冰片作用前后SD大鼠脑组织中伊文氏蓝(EB)量,评价冰片的开放血脑屏障作用;采用荧光分光光度计法准确定量测定冰片作用下大鼠脑内EB含量,评价冰片对EB透过血脑屏障的影响及其时效、量效关系。2、应用免疫组化法检测给予冰片后大鼠脑组织上P-gp的表达量,对比空白组和对照组,评价冰片对大鼠脑组织上P-gp表达量的影响,探讨冰片通过P-gp介导血脑屏障开放的可能作用机制。3、采用高效液相色谱法(HPLC)检测冰片作用前后脑组织中长春新碱(VCR)的浓度差,对比经典的P-gp阻断剂维拉帕米(Ver),进一步探讨中药冰片通过P-gp底物竞争性抑制作用介导血脑屏障开放的可能机制。结果:1、大体观察:注射EB后SD大鼠全身组织迅速变蓝,30s后动物的肌肉、皮肤及巩膜均呈淡蓝色。实验组大鼠的整个大脑皮质和小脑处,可见不均匀分布的、淡淡的蓝染,对照组则未见蓝染。2、荧光显微镜法:对照组仅偶见红斑,实验组可见大量卵圆形红斑,T= 15.02,P<0.01,差异有明显统计学意义。3、荧光分光光度计法:量效关系结果显示:F = 21.82,P<0.01,差异有统计学意义,不同剂量冰片可以影响脑组织中EB含量;0.25 g/kg.d剂量组中,脑组织EB含量最高;0.125 g/kg.d、0.25 g/kg.d、0.50 g/kg.d、1.00 g/kg.d各剂量组与对照组之间比较P﹤0.05,差异具有统计学意义;空白组与对照组之间比较P﹥0.05,差异没有统计学意义;时间效应检测结果显示:F = 9.53,P<0.01,差异有明显的统计学意义,冰片的作用时间可以影响脑组织中EB含量;0.5h、1h、24h、48h各时间点组间比较P﹥0.05,差异没有统计学意义,与0h、72h时比较P﹤0.05,差异具有统计学意义。4、免疫组化法:实验组的阳性表达率为55%,空白组和对照组的阳性表达率都为50%,实验组与空白组、对照组对比HC = 0.27(P﹥0.05),差异没有统计学意义。5、高效液相色谱法:给予SD大鼠0.25 g/kg.d剂量冰片时,可明显增加VCR的脑组织含量,与空白组相比较P﹤0.05,差异有统计学意义,与P-gp的经典阻断剂Ver作用相似。结论:1、芳香开窍类中药冰片具有开放血脑屏障,促使长春新碱、伊文氏蓝通过的作用;2、在SD大鼠上,冰片开放血脑屏障的量效关系表明:最佳剂量为0.25 g/kg.d;时效关系表明:由于冰片的开放效应,在0.5h到48h内伊文氏蓝在大鼠脑组织中都维持着较高且稳定的浓度。3、冰片并不能抑制SD大鼠脑组织中P-gp的表达量,但可以增加长春新碱的颅内药物浓度,发挥与P-gp经典抑制剂维拉帕米相似的作用,我们认为冰片开放血脑屏障的机制之一,可能是由于底物竞争性抑制影响了P-gp的功能。

全文目录

中文摘要  2-5
ABSTRACT  5-9
缩略语英汉对照表  9-10
前言  10-12
第一部分冰片开放血脑屏障的研究及时效量效关系检测  12-27
  1 实验材料  12-13
  2 实验方法  13-15
  3 统计学处理  15-16
  4 结果  16-20
  5 讨论  20-25
  6 结论  25-27
第二部分冰片介导P 糖蛋白开放血脑屏障的机制研究  27-41
  1 实验材料  28
  2 实验方法  28-33
  3 统计学处理  33
  4 实验结果  33-37
  5 讨论  37-40
  6 结论  40-41
全文小结及展望  41-42
参考文献  42-46
综述  46-54
致谢  54-55

冰片开放血脑屏障及通过P糖蛋白介导的机制研究

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