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含氰基拟除虫菊酯类农药多残留免疫检测方法的研究

作　者: 郝晓蕾
导　师: 胥传来
学　校: 江南大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: 农药多残留氰基除虫菊酯多克隆通用抗体间接ELISA
分类号: TS207
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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引　用: 3次
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内容摘要

农药残留免疫检测技术是国内外小分子快速检测的重要领域之一。本文针对含氰基拟除虫菊酯类杀虫剂,设计、合成了一种通用抗原,并制备得到了一种通用抗体。用自己制备的拟除虫菊酯类农药中间体间苯氧基苯甲氰醇（CPBA）经过一步衍生化,得到间苯氧基苯甲氰醇丁酸酯（CPBA-BE）,含有一个直链末端的羧基,用活性酯法在此羧基末端偶联载体蛋白牛血清蛋白（BSA）作为免疫抗原（CPBA-BE-BSA）,用混合酸酐法在此羟基末端偶联载体蛋白鸡卵清蛋白（OVA）作间接ELISA反应的包被抗原（CPBA-BE-OVA）。用紫外/可见分光光度计对合成的人工抗原进行全波长扫描,与半抗原和BSA、OVA的扫描结果进行比较,结果显示偶联物具备半抗原和蛋白的双重特征吸收峰,因此可以判断偶联成功,并估算免疫原和包被原的偶联比分别为17.9和13.2。用上述合成的人工免疫抗原（CPBA-BE-BSA）免疫四只新西兰大白兔,制备出四管抗血清,效价依次为102400、25600、25600、6400,用效价最高的1号新西兰大白兔的抗血清,针对与半抗原结构最相似的氟胺氰菊酯,来建立间接ELISA检测方法。包被原浓度为2μg/mL,抗体工作浓度为血清稀释20000倍,在此工作浓度下对间接ELISA方法进行系列优化,最终得到最佳的工作条件为包被液为pH=9.6的碳酸盐缓冲液,包被条件是4℃过夜,封闭液为含0.1%明胶的包被缓冲液,封闭时间为37℃2小时,标准品稀释液为添加30%体积甲醇、pH=6.5的50mM PBS。一抗反应时间和二抗反应时间都是30分钟,显液液配比为1:5,显色时间为15分钟。在此条件下作氟胺氰菊酯的标准曲线,线性方程为Y=-0.2036X+1.2051,R²=0.9655;线性范围为0.023-10μg/mL,IC₅₀为2.884μg/mL。并在此条件对13种拟除虫菊酯和代谢物进行交叉反应试验,抗体除可以识别氟胺氰菊酯外还对代谢物间苯氧基苯甲酸（PBA）和氯氟氰菊酯的IC₅₀分别为4.898μg/mL和9.772μg/mL,交叉反应率分别为58.88%和29.51%,而对不含氰基的拟除虫菊酯生物丙烯菊酯、苄呋菊酯、炔呋菊酯、胺菊酯等都没有抑制作用,达到含氰基拟除虫菊酯类杀虫剂多残留快速检测的要求。并用氟胺氰菊酯在自来水中做了添加回收实验,在自来水中平均添加回收率在64.84-80.02%之间,标准偏差彽于2.20%,验证了本方法的准确性。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章绪论  8-15
  1.1 我国拟除虫菊酯类农药残留的问题及安全现状  8-9
  1.2 拟除虫菊酯概论  9-10
    1.2.1 拟除虫菊酯的分子结构  9-10
    1.2.2 拟除虫菊酯的杀虫机理  10
    1.2.3 拟除虫菊酯的特点  10
  1.3 拟除虫菊酯的危害与残留  10-11
    1.3.1 毒理作用机制  10
    1.3.2 拟除虫菊酯的危害  10
    1.3.3 拟除虫菊酯的代谢  10-11
  1.4 拟除虫菊酯的检测技术  11-13
    1.4.1 拟除虫菊酯类农药残留的检测方法简介  11
    1.4.2 仪器检测方法  11
    1.4.3 免疫检测方法  11
    1.4.4 拟除虫菊酯类农药单残留免疫检测方法  11-12
    1.4.5 拟除虫菊酯类农药多残留免疫检测方法  12-13
  1.5 本课题研究的目标、内容  13-15
    1.5.1 研究目标  14
    1.5.2 研究内容  14-15
第二章含氰基拟除虫菊酯免疫原的合成与鉴定  15-25
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 主要试剂和药品  15-16
    2.1.2 主要仪器设备  16
  2.2 方法  16-18
    2.2.1 含氰基拟除虫菊酯半抗原的合成  16
    2.2.2 中间体CPBA的合成与提纯  16-17
    2.2.3 半抗原CPBA-BE的合成与提纯  17
    2.2.4 免疫抗原CPBA-BE-BSA的制备  17
    2.2.5 包被抗原CPBA-BE-OVA的制备  17
    2.2.6 中间体CPBA的鉴定  17
    2.2.7 半抗原CPBA-BE的鉴定  17-18
    2.2.8 免疫抗原CPBA-BE-BSA及包被抗原CPBA-BE-OVA的鉴定  18
    2.2.9 偶联比的计算  18
  2.3 结果  18-22
    2.3.1 中间体CPBA的液质联用分析鉴定  18
    2.3.2 半抗原CPBA-BE的液质联用分析鉴定  18-20
    2.3.3 免疫原CPBA-BE-BSA的紫外鉴定  20
    2.3.4 包被原CPBA-BE-OVA的紫外鉴定  20-21
    2.3.5 载体蛋白与半抗原CPBA-BE偶联比的计算  21-22
  2.4 讨论  22-24
    2.4.1 中间体的选择  22
    2.4.2 间隔臂的选择  22-23
    2.4.3 载体的选择  23
    2.4.4 偶联方法的选择  23-24
    2.4.5 最佳偶联比  24
  2.5 小结  24-25
第三章抗含氰基拟除虫菊酯抗体的制备与鉴定  25-30
  3.1 材料  25-26
    3.1.1 主要试剂和药品  25
    3.1.2 主要溶液  25
    3.1.3 主要仪器设备  25-26
  3.2 方法  26-27
    3.2.1 抗血清的制备  26
    3.2.2 抗血清的分离与保存  26
    3.2.3 抗血清的纯化  26-27
    3.2.4 抗含氰基拟除虫菊酯抗体效价的测定  27
  3.3 结果  27-28
    3.3.1 抗含氰基拟除虫菊酯抗体的效价  27-28
  3.4 讨论  28-29
  3.5 小结  29-30
第四章间接ELISA检测方法的建立与优化  30-47
  4.1 材料  30-31
    4.1.1 主要试剂和药品  30
    4.1.2 主要溶液  30
    4.1.3 主要仪器设备  30-31
  4.2 方法  31-35
    4.2.1 间接ELISA方法的建立  31-32
    4.2.2 间接ELISA方法的优化  32-33
    4.2.3 交叉反应率  33
    4.2.4 间接ELISA方法准确度的检测  33-34
    4.2.5 间接ELISA方法灵敏度的检测  34
    4.2.6 稳定性实验  34
    4.2.7 保存期实验  34-35
  4.3 结果  35-45
    4.3.1 间接ELISA方法的建立  35
    4.3.2 间接ELISA方法的优化  35-41
    4.3.3 间接ELISA检测方法标准曲线的绘制  41-42
    4.3.4 间接ELISA检测方法的特异性  42-43
    4.3.5 间接ELISA检测方法的准确率  43-44
    4.3.6 间接ELISA方法灵敏度  44
    4.3.7 稳定性实验  44
    4.3.8 保存期实验  44-45
  4.4 讨论  45-46
    4.4.1 ELISA方法的影响因素  45-46
    4.4.2 ELISA方法的评估  46
  4.5 小结  46-47
第五章结论  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-53
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53-55

含氰基拟除虫菊酯类农药多残留免疫检测方法的研究

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