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1. 重要细胞因子对肝前体细胞诱导分化实验 2. 丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达与腺病毒构建

作　者: 高亚丽
导　师: 唐霓
学　校: 重庆医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肝前体细胞 永生化 诱导分化 SV40T BMP LIF 丙型肝炎病毒 F蛋白 原核表达 腺病毒 同源重组
分类号: R373.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:目前临床治疗肝癌,肝硬化的主要手段是肝移植,但由于肝供体缺乏,手术风险大,费用高,易发生免疫排斥反应等原因制约了这一技术的发展,因此以肝细胞移植和生物人工肝为代表的肝细胞替代治疗,逐渐成为终末期肝病治疗研究的热点。而寻找合适的肝细胞来源则是肝细胞移植在临床上广泛开展的紧迫问题。肝前体细胞(Hepatic Progenitor cells, HP)直接参与肝脏的生长和发育,同时也是肝细胞移植和细胞再生的重要来源。其表型特征更接近肝细胞,在研究肝细胞的发育和分化、信号调控机理、肝细胞生物学以及病毒性肝炎发病机理和抗病毒药物筛选研究上是比胚胎干细胞更理想的细胞来源。本项目拟建立永生化的肝前体细胞克隆,为深入研究肝干细胞定向分化机制提供理想的实验材料,进一步在该细胞模型上筛选并优化高效的肝细胞定向分化诱导方法,探讨肝干细胞向肝细胞特异分化过程及分子机制,并着重进行HGF、LIF和BMP信号诱导肝前体细胞分化的实验研究。本项目不仅对解析肝脏发育机理、探索肝细胞定向分化具有重要的理论价值,并且可以通过人为调节肝细胞分化来获取充足和具备生物学功能的成熟肝细胞,为肝细胞移植、肝组织学工程、生物人工肝等治疗方式提供有效的细胞来源,具有潜在的临床应用前景。方法:运用LoxP位点特异修饰的SV40T逆转录病毒SSR#69导入胚胎肝细胞,建立永生化肝前体细胞,筛选和鉴定单克隆肝前体细胞株。体外诱导分化实验分别采用含人LIF、BMP2、BMP9基因的重组腺病毒感染肝前体细胞,在病毒感染后第4天、7天和10天用糖原染色和ICG摄取实验观察肝前体细胞的分化成熟度,并在第5、7、10天通过检测白蛋白启动子调控的荧光素酶报告基因活性,观察细胞诱导合成白蛋白情况。结果:成功建立了永生化肝前体细胞株,为体外观察肝前体细胞的诱导分化建立了良好的细胞模型。筛选并获得了4株单克隆肝前体细胞株,分别为HP13-6,13-19,14-2和14-19。其中HP13-6和14-19细胞形态均一,肝特异性基因的表达最强。体外诱导实验结果表明,BMP2和BMP9对HP14-19的诱导作用最强, PAS染色和ICG摄取细胞阳性率随诱导时间的延长明显上升,诱导后第7天效果最明显。PAS染色阳性细胞率BMP2和BMP9分别为30%和45%;ICG细胞阳性率BMP2和BMP9分别为40%和30%,荧光素酶活性普遍在诱导后第10天达高峰,HP13-6细胞对BMP9的诱导应答最强,酶活性增加了近10倍,其次为LIF(8倍),BMP2(7倍)和HGF(6倍);HP14-19则对BMP2的应答效果最佳,酶活性增加了7倍,其次为LIF(5倍),HGF(2.5倍)。LIF诱导HP14-19后,PAS染色和ICG摄取细胞阳性率略为增加,荧光素酶活性有一定变化,提示LIF对HP14-19诱导作用不明显。结论:建立永生化的肝前体细胞模型,筛选并获得了4株具有代表性的单克隆肝前体细胞株,BMP2和BMP9能够诱导HP14-19向发育晚期肝细胞分化,并初步具备成熟肝细胞的一些功能。目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)呈世界范围内流行,全球大约有1.8亿人被感染,感染丙型肝炎病毒是发生肝癌的一个重要因素,大约2-5%的HCV感染者最终发展成肝癌。迄今为止,HCV的疫苗尚未解决,干扰素加利巴韦林是治疗丙型肝炎的主要方法,但其最终疗效还不能明确。丙型肝炎病毒是单链正股RNA病毒,长约9.6Kb,编码由3000个氨基酸残基组成的多氨酸。蛋白前体最后加工成10个成熟的蛋白:核心蛋白(core)、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。F蛋白是核心蛋白在翻译过程中核糖体发生移位产生的,但目前对它的生物学性质还不了解,F蛋白在肝癌的发生中起了什么作用?F蛋白对细胞的影响是什么?这些都是值得深入研究的问题。本课题构建F蛋白的原核表达载体并纯化F蛋白,有利于下一步单克隆抗体的制备,构建F蛋白的腺病毒载体,为深入研究F蛋白的生物学功能奠定了基础。方法:本研究内容分为两部分,第一部分以pET32a(+)为载体,构建F蛋白的原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达F蛋白。主要技术路线为:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His标签的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌克隆菌株JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,再次转化大肠杆菌表达菌BL21后经IPTG诱导,出现了与预期分子量相符的蛋白条带。表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化。第二部分,构建含有HCV F蛋白重组腺病毒载体,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183同源重组后转染HEK293细胞,包装成腺病毒并经多轮扩增,得到高滴度的感染病毒。结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,进一步通过Western blot证实成功表达了含有6×His tag蛋白的融合蛋白。测序及酶切鉴定结果表明:目的基因正确插入腺病毒穿梭质粒,转染HEK293细胞后在荧光显微镜下观察,细胞中含有绿色荧光。结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化重组融合蛋白,构建了含有F基因的腺病毒载体,得到高滴度的腺病毒,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础。

全文目录


符号说明  9-11
摘要  11-14
ABSTRACT  14-17
一、重要的细胞因子对肝前体细胞诱导分化实验  17-42
  前言  17-18
  1 材料与方法  18-22
    1.1 材料  18-19
      1.1.1 实验动物及细胞来源  18
      1.1.2 主要试剂  18
      1.1.3 主要设备  18-19
    1.2 方法  19-22
      1.2.1 细胞培养  19
      1.2.2 提取细胞总RNA  19
      1.2.3 逆转录PCR  19-20
      1.2.4 各基因PCR 检测  20
      1.2.5 病毒感染滴度的确定  20-21
      1.2.6 荧光素酶活性检测  21
      1.2.7 PAS 染色观察细胞功能的改变  21
      1.2.8 ICG 摄取  21-22
  2 实验结果  22-28
    2.1 永生化肝前体细胞的形态  22
    2.2 Real-time PCR 检测肝脏发育不同阶段标志物  22-24
    2.3 永生化肝前体细胞单克隆细胞株形态  24-25
    2.4 病毒感染滴度的确定  25
    2.5 荧光素酶活性检测  25-26
    2.6 PAS 染色  26-27
    2.7 ICG 摄取  27-28
  3 讨论  28-32
    3.1 永生化肝前体细胞株的建立  28
    3.2 肝细胞发育不同阶段标志物的表达及意义  28-29
    3.3 永生化肝前体细胞克隆的筛选  29-30
    3.4 特定细胞因子诱导肝前体细胞分化的作用  30-32
  4 结论  32-33
  全文总结  33-34
  参考文献  34-42
二、丙型肝炎病毒F 蛋白的原核表达与腺病毒构建  42-89
  摘要  42-44
  ABSTRACT  44-47
  正文  47-80
    前言  47-49
    第一部分 丙型肝炎病毒F 蛋白原核表达载体的构建表达和纯化  49-66
      1 材料  49-51
        1.1 质粒与菌株  49
        1.2 主要试剂  49-50
        1.3 其它试剂  50-51
        1.4 主要仪器  51
      2 方法  51-61
        2.1 F 基因引物设计  51-52
        2.2 F 基因扩增  52
        2.3 PCR 产物纯化  52-53
        2.4 PCR 产物回收  53
        2.5 pET-32a(+)载体的制备  53-54
          2.5.1 碱裂解法提取pET-32a(+)  53-54
          2.5.2 载体酶切  54
        2.6 目的基因与载体连接  54-55
        2.7 连接产物转化大肠杆菌JM109  55
          2.7.1 化学感受态大肠杆菌JM109 的制备  55
          2.7.2 转化  55
        2.8 重组质粒的鉴定  55-57
          2.8.1 菌落PCR  55-56
          2.8.2 重组质粒酶切鉴定  56-57
          2.8.3 测序鉴定  57
        2.9 F 基因的高效表达  57-59
          2.9.1 F 蛋白的诱导表达  57-58
          2.9.2 纯化重组蛋白的免疫印迹鉴定（Western blot）  58-59
          2.9.3 重组质粒的大量诱导表达  59
          2.9.4 判断重组蛋白在大肠杆菌的表达  59
        2.10 包涵体的纯化  59-61
          2.10.1 破碎细菌  59-60
          2.10.2 洗涤溶解包涵体  60
          2.10.3 亲合层析纯化  60-61
      3 结果  61-64
        3.1 PCR 扩增产物鉴定  61
        3.2 重组质粒酶切与PCR 鉴定  61-62
        3.3 F 蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 分析  62-63
        3.4 融合蛋白的Western blot 鉴定  63-64
        3.5 表达蛋白的复性与亲和层析纯化  64
      4 讨论  64-65
      5 结论  65-66
    第二部分丙型肝炎病毒F 蛋白腺病毒的构建  66-80
      1 材料  66-67
        1.1 质粒、菌株、细胞株  66
        1.2 主要试剂  66
        1.3 主要仪器  66-67
      2 方法  67-74
        2.1 目的基因的获取  67-68
          2.1.1 引物设计  67
          2.1.2 PCR 扩增F 基因  67-68
          2.1.3 乙醇沉淀法纯化DNA  68
        2.2 目的基因与穿梭质粒连接  68-70
          2.2.1 BamHⅠ和 HindIII 酶切穿梭质粒 pAdTrack-TO4  68-69
          2.2.2 连接  69
          2.2.3 电转感受态细菌JM109 的制备  69-70
          2.2.4 转化  70
        2.3 重组质粒的鉴定  70-71
          2.3.1 菌落PCR（方法同前）  70
          2.3.2 酶切鉴定  70
          2.3.3 测序鉴定  70-71
        2.4 穿梭质粒与骨架质粒于BJ5183 内同源重组  71
          2.4.1 碱裂解法提取骨架质粒AdEasy-1  71
          2.4.2 电转AdEasy-1 入BJ5183 菌（方法同前）  71
          2.4.3 电转感受态BJ5183 的制备（方法同前）  71
        2.5 重组质粒pAdTrack-T04-F 线性化  71
        2.6 电转pAdTrack-T04-F 入含有骨架质粒的BJ5183 菌（方法同前）  71
        2.7 重组腺病毒质粒鉴定  71-72
          2.7.1 菌落PCR（方法同前）  71
          2.7.2 酶切鉴定  71-72
        2.8 Mini 方法提取阳性质粒，转化DH5α（过程同前）  72
        2.9 质粒快速抽提纯化试剂盒（promega）提取质粒  72
        2.10 腺病毒质粒准备  72-73
        2.11 HEK293 细胞转染  73
        2.12 荧光检测  73
        2.13 腺病毒包装  73-74
      3 结果  74-77
        3.1 PCR 扩增目的基因  74
        3.2 酶切鉴定  74-75
        3.3 重组质粒 PCR 鉴定  75
        3.4 骨架质粒转化  75-76
        3.5 酶切鉴定  76-77
        3.6 转染  77
      4 讨论  77-79
      5 结论  79-80
  全文总结  80-81
  参考文献  81-89
致谢  89-90
攻读学位期间发表的学术论文  90

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒） > 肠道病毒与肝炎病毒 > 传染性肝炎
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