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胃粘膜单细胞悬液的制备及其蛋白的初步分析

作　者: 曹金鹏
导　师: 龚建平
学　校: 华中科技大学
专　业: 普通外科学
关键词: 胃粘液单细胞悬液细胞周期蛋白流式细胞仪膜蛋白 SDS-PAGE电泳
分类号: R573
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 39次
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内容摘要

目的寻找一种方法能够有效的去除胃粘液,把胃粘膜制备成单细胞悬液,可以进行胃粘膜流式细胞术等单细胞的蛋白分析研究,为即将在胃组织开展细胞组学做好准备,并以体外培养的Molt-4单细胞悬液作为参照。方法应用不同浓度的胃蛋白酶尝试去除胃粘液和分离粘膜层后,再使用机械法制备成单细胞悬液,用DNA直方图来验证获得单细胞的各周期比例,并和未用胃蛋白酶处理的胃粘膜组织蛋白用Western来对比周期蛋白的表达,应用细胞免疫组织化学流式细胞术和激光共聚焦显微镜技术初步检测胃粘膜细胞主要周期蛋白CyclinD、E、A、B1的表达。结果0.05-0.1%的胃蛋白酶和1.2-2.4u/ml的dispase分别能够较好的去除胃粘液,获得粘膜层,从而制备成胃粘膜单细胞悬液,从而能够进行单细胞分析,可以从流式中首次系统的显示出其细胞主要周期蛋白的时相性表达规律:CyclinD3,B1明显表达,CyclinD2较弱,CyclinD1,A,E表达不明显,并得到Western和激光扫描共聚焦显微镜的验证。结论利用胃蛋白酶,dispase作用后能够去除胃粘液,较容易获得胃粘膜单细胞悬液,并通过应用细胞免疫组织化学流式细胞术和激光共聚焦显微镜技术初步检测胃粘膜细胞主要周期蛋白CyclinD、E、A、B1的表达,提示体内的细胞周期蛋白的表达规律与体外培养的细胞系的表达规律不同。目的用酶消化胃粘液后把胃粘膜制备成单细胞悬液,用其进行膜蛋白的提取,并和直接获得的组织蛋白进行对比,并以体外培养的Hela单细胞悬液作为参照,为即将在胃组织开展细胞组学提供膜蛋白组学方面的支持。方法应用0.1%胃蛋白酶去除胃粘液,用1.2-2.4u/ml的dispase分离粘膜层后,再使用机械法制备成单细胞悬液,然后用Triton-114进行了膜蛋白与胞内蛋白的分离,并用免疫印记Western技术来验证部分膜蛋白的表达,并进行了SDS-PAGE电泳。结果0.1%的胃蛋白酶和1.2-2.4u/ml的dispase分别能够较好的去除胃粘液,制备成胃粘膜单细胞悬液,可以进行膜蛋白的提取。用Triton-114提取的膜蛋白经Western验证,可以见到膜蛋白(Na+/K+ATPase,caveolin等)的富集,可以在SDS-PAGE电泳显示出膜蛋白条带。结论利用胃蛋白酶,dispase作用后能够去除胃粘液,较容易获得胃粘膜单细胞悬液,利用去污剂Triton-114可以尝试进行膜蛋白的提取,可进行提膜蛋白等进行蛋白组学分析。

全文目录

引言  5-8
第一部分：胃粘膜单细胞悬液的制备及其周期蛋白的表达  8-21
  1. 中文摘要  8-9
  2. 英文摘要  9-10
  3. 前言  10
  4. 材料和方法  10-13
  5. 实验结果  13-17
  6. 讨论  17-19
  7. 参考文献  19-21
第二部分：胃粘膜单细胞悬液膜蛋白的初步提取  21-31
  1. 中文摘要  21-22
  2. 英文摘要  22-23
  3. 前言  23-24
  4. 材料和方法  24-27
  5. 实验结果  27-29
  6. 讨论  29-30
  7. 参考文献  30-31
全文总结  31-32
文献综述  32-43
致谢  43

胃粘膜单细胞悬液的制备及其蛋白的初步分析

内容摘要

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