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临床分离肺炎克雷伯菌的耐药性及KPC型碳青霉烯酶的研究

作　者: 王鹏
导　师: 熊自忠
学　校: 安徽医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶耐药性 KPC PCR 接合子转化子碳青霉烯类
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言:近二十多年来,随着β-内酰胺类抗菌药物特别是第三代头孢菌素如头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶的大量使用,使得世界各地产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的检出率逐年上升,同时产ESBLs菌株引起的医院内感染发病率也逐年升高,甚至在某些医院引起爆发流行。革兰阴性菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等,耐药的主要机制就是产生能水解氧亚氨基β-内酰胺类抗菌药物的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。由于这类酶能水解的底物谱较广谱酶更广,故称之为超广谱β-内酰胺酶。了解产ESBLs菌株的耐药性特点,有利于防止产ESBLs菌株的区域性流行,并指导临床合理治疗,以免延误病情和造成不必要的浪费。目的:了解临床分离肺炎克雷伯菌的耐药性和产ESBLs菌株的发生率。方法:收集安徽医科大学第一附属医院2005年和2008年临床分离的肺炎克雷伯菌共87株(其中2005年38株,2008年49株)。采用琼脂稀释法检测其对常用抗菌药物的耐药性。CLSI确证试验(纸片增强法)检测出产ESBLs菌株。结果:2005年肺炎克雷伯菌对哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、氯霉素的耐药率均大于70%;对氟喹诺酮除左氧氟沙星和加替沙星,耐药率均大于50%;对亚胺培南和美罗培南极其敏感,耐药率为0;对哌拉西林/三唑巴坦、头孢他啶和阿米卡星的耐药率均低于50%。2008年肺炎克雷伯菌对哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、氯霉素的耐药率大于或接近80%;对氟喹诺酮除了加替沙星,耐药率均大于60%,甚至超过80%;对亚胺培南和美罗培南出现一个株耐药耐药率为2%;对哌拉西林/三唑巴坦、头孢他啶和阿米卡星的耐药率均低于50%。比较2个年份的耐药率,2008年头孢唑啉、头孢吡肟、氧氟沙星和左氧氟沙星的耐药率较2005年有显著提高(P﹤0.05)。2005年产ESBLs菌株的检出率为36.8%; 2008年产ESBLs菌株的检出率为57.1%,未显示有明显差异(P﹥0.05),统计2个年份的产ESBLs菌株总检出率为48.2%。产ESBLs菌株显示多重耐药,对哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、左氧氟沙星及环丙沙星等多种抗生素的耐药率高于非产酶株(P﹤0.01)。结论:1.我院2005年和2008年肺炎克雷菌对青霉素类、第一代和第二代头孢菌素、头孢噻肟、氯霉素和大多数氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率均在50%以上;对阿米卡星、头孢他啶和哌拉西林/三唑巴坦耐药率低于50%;对碳青霉烯类抗菌药物仍十分敏感,但有少数菌株显示不敏感。其中头孢唑啉、头孢吡肟、氧氟沙星和左氧氟沙星的耐药率2008年较2005年有显著提高(P﹤0.05)。2.我院ESBLs菌株的检出率高,2005年产ESBLs菌株的检出率和2008年产ESBLs菌株的检出率未显示有明显差异(P﹥0.05)。产ESBLs菌株多重耐药显著,产酶株耐药率明显高于非产酶株耐药率(P﹤0.01)。3.由于产ESBLs菌株对包括三、四代头孢菌素在大多数β-内酰胺类抗生素和多数氟喹诺酮类抗菌药物耐药,且多重耐药显著,此类菌株的严重感染一般首选碳青霉烯类,如亚胺培南、美罗培南等。前言:近年来,碳青霉烯类抗菌药物,包括美罗培南、亚胺培南和厄他培南等被广泛的应用于临床治疗革兰阴性细菌,如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠肝菌等。特别用于治疗重度或多重耐药菌株的感染,取得了不错的疗效。但是同时,也导致了能够广泛水解包括美罗培南和亚胺培南在内的多种β-内酰胺类抗菌药物的碳青霉烯酶的产生和流行。产KPC型酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要耐药机制之一。KPC型酶属于A类β内酰胺酶,几乎能够水解几乎所有β-内酰胺类抗生素。对氨苄西林和哌拉西林有较强水解作用,对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟和氨曲南水解作用不及青霉素类和一代头孢(头孢唑啉)和二代头孢(头孢呋辛),对头孢他啶、头孢吡肟水解作用较弱。β-内酰胺类酶抑制剂可以抑制酶的水解作用。目的:肺炎克雷伯菌中KPC酶基因的检测及克隆表达。方法:根据CLSI 2008的规定,选择对亚胺培南或/和美罗培南MIC≥2mg/L的肺炎克雷伯菌为产KPC酶可疑菌株。根据1-4型KPC酶编码基因序列设计通用引物和全编码基因引物,首先通过通用引物的聚合酶链反应(PCR)晒查出阳性菌株,再扩增KPC酶全编码基因并测序,结果在GenBank比对。将PCR产物与PHSG398质粒载体连接后转化入感受态细胞JM109,含有氨苄西林和氯霉素的M-H平板筛选出转化子。通过与大肠埃希菌J53转移接合,含有氨苄西林和叠氮钠的M-H平板筛选出接合子。琼脂稀释法测定临床株、转化子和接合子的MIC。结果:对亚胺培南或/和美罗培南MIC≥2mg/L的肺炎克雷伯菌12株(2005年4株;2008年8株)。PCR反应扩增出一株阳性,全编码基因产物经过测序和比对证实为KPC-2型酶基因。临床株对全部抗菌药物均表现耐药;转移接合子除了对哌拉西林、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛和氯霉素表现耐药,对其余包括碳青霉烯类在内其余多种β-内酰胺类抗菌药物显示低水平耐药(比大肠埃希菌J53的MIC值升高8倍或以上);转化子除了对氨苄西林和氯霉素表现耐药外,对包括美罗培南和亚胺培南在内其余多种β-内酰胺类抗菌药物显示低水平耐药(比大肠埃希菌JM109的MIC值升高8倍或以上);β-内酰胺酶抑制剂可明显降低产酶菌株的耐药性。结论:1.本次研究首次在安徽省临床分离的肺炎克雷伯菌中检出KPC-2型碳青霉烯酶基因。2.产酶临床株显示多重耐药。转化子对包括碳青霉烯类在内的多种β-内酰胺类抗菌药物显示低水平耐药,β-内酰胺酶抑制剂可明显抑制该酶的水解作用。3.转移接合成功,表明KPC-2型碳青霉烯酶基因位于质粒上,并且具有水平传播的可能。

全文目录

一、缩略词表  6-8
二、摘要(临床分离肺炎克雷伯菌的耐药性及KPC 型碳青霉烯酶的研究)  8-16
  第一部分中文摘要  8-10
  第一部分英文摘要  10-12
  第二部分中文摘要  12-14
  第二部分英文摘要  14-16
三、第一部分正文(临床分离肺炎克雷伯菌的耐药性及产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株的检测)  16-32
  前言  16-17
  材料和方法  17-20
  结果  20-22
  讨论  22-24
  结论  24-28
  参考文献  28-32
四、第二部分正文(临床分离肺炎克雷伯菌中产KPC 型碳青霉烯酶基因的检测及克隆表达)  32-48
  前言  32-33
  材料和方法  33-41
  结果  41-43
  讨论  43-45
  结论  45-47
  参考文献  47-48
五、附录  48-49
致谢  49-50
综述  50-57
  参考文献  55-57

临床分离肺炎克雷伯菌的耐药性及KPC型碳青霉烯酶的研究

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