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rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞杀伤机理的初步研究

作　者: 向生光
导　师: 胡维新
学　校: 中南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乳腺癌自杀基因治疗重组腺相关病毒(rAAV) HSVtk/GCV p21
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 16次
引　用: 1次
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内容摘要

乳腺癌是人类常见的一种恶性肿瘤,也是女性主要恶性肿瘤之一。手术、放疗、化疗是目前肿瘤治疗的主要手段。随着现代分子生物学及基因工程技术的发展,基因治疗成为肿瘤治疗的新模式。自杀基因疗法是基因治疗的策略之一,它通过转基因的方法将哺乳动物不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内,其表达产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的代谢产物,影响细胞的生物合成,最终导致细胞死亡。本研究中,我们以人类乳腺癌细胞株MCF-7为实验对象,利用重组腺相关病毒介导的含Tet-On调控元件的HSVtk自杀基因系统对该细胞株进行杀伤性试验,并利用基因芯片、RT-PCR、Western Blotting等手段对该系统对乳腺癌细胞杀伤作用的分子机理进行初步研究。第一章rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用通过磷酸钙共沉淀法转染pAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、pHelper、pAAV-RC三质粒至病毒包装细胞HEK293T,获得了重组腺相关病毒rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk。经纯化后,以斑点杂交的方法检测并计算得到所获得的rAAV的病毒物理滴度为3.49×10¹¹/ml。培养MCF-7细胞,以rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、Dox、GCV的不同组合处理该细胞。实验分为rAAV+Dox+GCV组、rAAV+GCV组、rAAV+Dox组、rAAV组及阴性对照组。通过MTT试验检测药物对细胞生长的影响,发现药物处理细胞72h后,rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组,细胞相对数量显著减少（P＜0.05）。以流式细胞术检测HSVtk自杀基因系统处理MCF-7细胞后细胞周期的改变情况,发现rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组细胞,S期的细胞显著增多（P＜0.05）,表明该系统干预乳腺癌细胞后,细胞周期S期受阻。第二章rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞杀伤机理的初步研究药物处理乳腺癌细胞MCF-7 48 h后,提取细胞的总RNA,利用全基因芯片检测药物对该细胞内基因表达谱的影响。结果显示,rAAV+Dox+GCV处理组细胞相对与其他各处理组细胞:上调基因246个,下调基因64个,其中与DNA复制、DNA损伤与修复相关的基因比较多,以及很多锌指结构蛋白。RT-PCR验证了p21与PCNA在rAAV+Dox+GCV处理组与阴性对照组细胞之间的表达差异,结果显示p21表达显著上调,而PCNA表达显著下调,与芯片结果一致。进一步利用Western Blotting研究药物干预后相关蛋白质p21、PCNA、CDK1、Cyclin B、p53及磷酸化p53（Ser6）等蛋白的表达变化。结果显示,相对于阴性对照组,rAAV+Dox+GCV处理组的p21蛋白表达量上调,而PCNA、CDK1、Cyclin B等蛋白表达量下调;而p53及磷酸化p53（Ser6）的表达在rAAV+Dox+GCV处理组与阴性对照组之间无显著差异。因此我们推测,HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用可能是通过一种非p53依赖性的途径上调p21的表达,进而导致PCNA、Cyclin B、CDK1等在细胞内的含量降低,使细胞周期受阻,并最终导致乳腺癌细胞的死亡。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
英文缩略词  12-13
前言  13-18
实验技术路线  18-19
第一章 rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用  19-33
  一、材料与方法  19-28
  二、结果  28-31
  三、讨论  31-33
第二章 rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞杀伤机理的初步研究  33-55
  一、材料与方法  33-42
  二、结果  42-52
  三、讨论  52-55
结论  55-56
参考文献  56-61
综述  61-68
致谢  68-69
个人简历  69

rAAV介导的HSVtk自杀基因系统对乳腺癌细胞杀伤机理的初步研究

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