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犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段的原核表达及初步应用

作　者: 丁德
导　师: 张守发
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬新孢子虫吉林株 NcSRS2基因片段表达反应原性间接ELISA
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 39次
引　用: 1次
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内容摘要

新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于犬、牛、马、羊等多种宿主动物细胞内而引起的一种原虫病。该病对牛的危害尤为严重,主要造成孕畜流产、死胎以及新生犊牛的运动神经系统疾病,已给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。国外学者在新孢子虫的致密颗粒棒状体内以及速殖子表面发现了新孢子虫表面蛋白NcSRS2,NcSRS2表面蛋白介导其粘附及入侵宿主细胞,可以作为酶联免疫吸附试验有效的抗原成分,是最有希望的新孢子虫疫苗的侯选抗原。本研究利用PCR技术扩增和克隆了1 100bp犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段,对所克隆的NcSRS2基因序列与基因库中已发表的序列(AY940488)进行比较分析。结果表明同源性达到99.8%,证明了该基因片段为犬新孢子虫NcSRS2基因。将NcSRS2基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功构建了融合表达载体pGEX-NcSRS2。将构建好的融合表达载体,在1mmol/L的IPTG诱导下,在大肠杆菌BL21中得到大量表达,经过8 h表达量达到高峰。融合蛋白GST-NcSRS2的分子量为64.4 ku,大部分以可溶性蛋白的形式存在。用亲和层析方法对GST-NcSRS2融合蛋白进行了纯化,获得了理想的纯化结果。经Western blotting免疫印迹分析,融合蛋白与犬新孢子虫阳性血清发生特异性反应,而同刚地弓形虫阳性血清没有交叉反应,说明该蛋白具有很好的抗原性和特异性。本研究应用纯化后的GST-NcSRS2融合蛋白建立了检测犬新孢子虫抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原浓度为4μg/mL、被检血清稀释度为1:40、酶标二抗稀释度为1:2 000为最佳工作浓度。该方法不与牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、牛巴贝斯虫等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法与玄学南等建立的间接ELISA方法平行检测128份牛血清样本,结果表明,所建立方法更加敏感,说明建立的ELISA适用于犬新孢子虫抗体的检测。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
引言  10-22
  1 新孢子虫病原学研究进展  10-12
  2 新孢子虫病流行病学及危害  12-13
  3 新孢子虫病防治研究进展  13-17
    3.1 临床诊断  13
    3.2 病理组织学检查  13-14
    3.3 血清学诊断  14-15
    3.4 分子生物学诊断方法  15-16
    3.5 动物接种试验  16-17
  4 新孢子虫主要抗原研究进展  17-19
    4.1 表面抗原  17
    4.2 微线抗原  17-18
    4.3 颗粒抗原  18-19
  5 牛新孢子虫疫苗的应用研究  19-20
    5.1 免疫预防的应用前景  19
    5.2 活疫苗与死疫苗  19-20
    5.3 牛新孢子虫疫苗的应用研究  20
  6 本研究目的及意义  20-22
材料与方法  22-39
  1 材料  22-29
    1.1 病料来源  22
    1.2 虫体培养所用材料  22
    1.3 载体与菌株  22
    1.4 主要试剂  22
    1.5 试验所用溶液及其配制  22-28
    1.6 主要仪器设备  28-29
  2 方法  29-39
    2.1 犬新孢子虫吉林株虫体的分离与鉴定  29-30
    2.2 PCR产物的回收  30
    2.3 感受态细胞的制备(CaCl2法)  30-31
    2.4 NcSRS2 DNA与pWD18-T Simple Vector的重组连接  31
    2.5 重组连接后质粒DNA的转化  31
    2.6 重组克隆的筛选  31
    2.7 质粒DNA的小量制备(碱性裂解法)  31-32
    2.8 重组质粒的鉴定  32
    2.9 序列测定及分析  32
    2.10 重组表达载体的构建  32-33
    2.11 重组表达载体的鉴定  33-34
    2.12 重组融合表达质粒的诱导表达  34
    2.13 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  34-35
    2.14 融合蛋白Western-blotting分析  35-36
    2.15 重组蛋白的大量表达  36
    2.16 包涵体的鉴定  36
    2.17 亲和层析法纯化融合蛋白(Batch法)  36-37
    2.18 ELISA诊断方法的建立  37-39
结果  39-53
  1 犬新孢子虫吉林株虫体的分离与鉴定  39-40
  2 目的基因的克隆及重组质粒的鉴定  40-42
  3 pMD18-T-NcSRS2重组质粒的序列测定及同源性分析  42-43
  4 重组表达载体的构建及鉴定  43-45
  5 重组表达质粒的序列测定及分析  45-47
  6 重组表达载体pGEX-NcSRS2的表达  47
  7 融合蛋白Western-blotting分析  47-48
  8 蛋白存在形式的鉴定  48
  9 重组蛋白的亲和层析纯化  48-49
  10 以重组蛋白NcSRS2为抗原的ELISA试验  49-53
讨论  53-58
  1 犬新孢子虫吉林株的分离与鉴定  53
  2 新孢子虫病的诊断  53-54
  3 目的基因的扩增与克隆  54
  4 表达载体pGEX-4T-2  54-55
  5 重组表达质粒的构建和鉴定  55-56
  6 NcSRS2重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达  56
  7 以重组NcSRS2蛋白为抗原的ELISA试验  56-58
结论  58-59
参考文献  59-71
致谢  71-72
作者简介  72-73
附录 (攻读学位期间发表论文目录)  73-74

犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段的原核表达及初步应用

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