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结直肠癌淋巴结转移相关分子的定量蛋白质学研究

作　者: 黄利勇
导　师: 蔡三军
学　校: 复旦大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 结直肠癌淋巴结转移预后蛋白质组学 S100A4
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：原发性肿瘤发生转移是结直肠癌治疗失败的最主要原因,其最常见的转移方式是通过淋巴道进行肿瘤细胞播散——淋巴结转移。患者如发生淋巴结转移,其长期生存概率将会明显低于无淋巴结转移患者,并且淋巴结是否发生转移会直接对肿瘤分期、预后判断及临床治疗方案的选择提供重要信息。为了研究结直肠癌淋巴结转移的分子机制,以提高对结直肠癌的诊断及治疗效果,我们采用定量蛋白质组学及相关分子生物学技术为研究方法,对结直肠癌伴有和不伴有淋巴结转移的原发癌组织进行实验研究,依此为筛选潜在结直肠癌淋巴结转移分子标志物及为病人的临床个体化治疗提供依据。材料与方法：病人及标本：实验所需的144例标本均来自复旦大学附属肿瘤医院/上海市肿瘤医院大肠外科。所有病人均签署过知情同意书,且在手术前均未接受过化疗/放疗等相关抗肿瘤治疗。标本的病理诊断标准参照美国抗癌协会《肿瘤分期》(第六版,2002年)。在蛋白分子的筛查及验证实验中,我们搜集了32例2009年于我院行结直肠癌根治性手术的新鲜标本,根据术后病理结果分成淋巴结转移阴性及淋巴结转移阳性两组,每组各16例。淋巴结转移阴性组中的每例标本的淋巴结检出数不少于12枚。32例病人均无远处转移。对筛查出的潜在分子标志物的进一步临床研究,我们搜集了2004年1月至6月于我院手术的112例结直肠癌病人的石蜡标本进行免疫组织化学检查。此研究项目经过上海市肿瘤医院伦理委员会审核通过。蛋白质样品制备、甲基化稳定同位素标记及二维液相色谱结合串联质谱：32例新鲜标本分别提取总蛋白、纯化、定量。来自淋巴结阴性组及阳性组的各16例样本分别等量混合成两个样本(即淋巴结阴性组和淋巴结阳性组)。两组样本各取100微升,在经胰蛋白酶消化后分别进行稳定同位素标记：淋巴结阳性组行d0甲基酯化标记,阴性组行d3甲基酯化标记。两组样品最后混合除盐,经二维高效液相色谱分离后进行串联质谱分析(LTQ Orbitrap)数据分析：所产生的质谱图用Bioworks 3.3.1进行处理,产生不同的峰面积图。使用SEQUEST算法搜寻国际蛋白索引(IPI 3.43)得到相对应蛋白质名。蛋白差异表达>2.5倍,P<0.05被设定为明显差异表达蛋白。免疫印迹：32例进行筛查的蛋白样品各取30微克进行免疫印迹实验,β-actin作为内参。得到的条带应用密度测定进行相对定量对比。荧光定量PCR：32例新鲜标本分别抽提mRNA,进行实时定量PCR,β-actin作为内参,进行转录水平验证。免疫组化：取新鲜标本相对应的石蜡标本切片进行免疫组化检查,观察正常粘膜、淋巴结阴性肿瘤、淋巴结阳性肿瘤及其相应的转移淋巴结中目标蛋白的表达情况及其在细胞中定位情况。取112例有随访资料的独立样本的石蜡切片同样地进行免疫组化实验,以进一步在更大临床样本中分析目标蛋白的表达情况及其临床意义分析。结果：甲基化稳定同位素标记结合二维色谱/串联质谱的定量蛋白质组学分析：经过β-酪蛋白校准后,我们发现共有644种蛋白差异表达。表达差异在2.5倍以上的蛋白有43个(6.7%),其中上调2.5倍以上有28个,下调2.5倍以下有15个。按照Geneontology进行功能分类,它们主要参与酶活性、结合活性、细胞运动、信号传导、转录调控、酶调节、转运活性、凋亡及其它等方面生物学功能。差异蛋白S100A4的验证：分别在蛋白表达水平及转录水平对在淋巴结转移组中明显高表达的蛋白S100A4进行验证。免疫印迹及免疫组化均表明S100A4在淋巴结阳性组中较阴性组中明显高表达。免疫印迹经密度相对定量比较,阳性组中S100A4表达量较阴性组明显增高(p<0.001)。免疫组织化学发现正常粘膜细胞S100A4染色阴性,阴性组肿瘤细胞S100A4染色弱阳性,阳性组及相应的转移淋巴结中肿瘤细胞的S100A4染色阳性。S100A4蛋白主要定位于细胞质和/或细胞核中。荧光定量PCR显示S100A4的mRNA与蛋白水平的差异趋势一致(p<0.001)。S100A4的表达与临床病理特点及与预后的关系：S100A4的高表达与淋巴结转移、肿瘤TNM分期晚相关(p<0.001),但与性别、年龄、肿瘤分化、肿瘤大小及肿瘤部位无关。此外,S100A4高表达的病人其5年复发率显著增高以及5年生存率显著降低(p<0.001)。单因素及多因素分析显示S100A4的表达是肿瘤复发与生存的独立预测因子(p<0.05)。结论：本实验应用定量蛋白质组学技术筛查出一组与结直肠癌淋巴结转移相关的差异表达蛋白,可作为潜在的结直肠癌淋巴结转移相关的分子标志物和治疗靶点。进一步研究显示,蛋白质S100A4的高表达与结直肠癌淋巴结转移以及预后密切相关,S100A4可作为结直肠癌的分子标志物。

结直肠癌淋巴结转移相关分子的定量蛋白质学研究

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