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双孢蘑菇PPO的提取、纯化及特性测定

作　者: 王健
导　师: 王相友
学　校: 山东理工大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 双孢蘑菇 多酚氧化酶 纯化 酶学特性
分类号: TS219
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)催化的酶促褐变是导致双孢蘑菇(Agaricus bisporus)采后褐变的主要原因。本文依据蛋白质的溶解度、分子大小和所带电荷分别不同,严格控制实验温度,采取3步离心抽提DEAE-Cellulose-52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析共5步处理对双孢蘑菇多酚氧化酶进行了分离纯化。经活性、含量检测和SDS-PAGE电泳测定得出,PPO比活为566.57U·mg-1,蛋白产率为0.47%,相对分子质量为27.27kDa,纯化倍数为103.20。原子力显微镜观察显示,双孢蘑菇中的多酚氧化酶属于椭球状蛋白。以邻苯二酚为底物,利用纯化后的双孢蘑菇多酚氧化酶,得出其最适反应的pH为6.8；最适温度为20℃,对热稳定性差,50℃时处理10分钟酶即基本丧失活性；最适底物浓度为0.06mol·L-1;米氏常数Km=0.1072mol·L-1,最大反应速率Vmax=0.0239U·min-1。L-半胱氨酸能在低浓度下对双孢蘑菇多酚氧化酶起到强烈抑制作用,在0.5mmol·L-1时,即可完全抑制其活性；抗坏血酸、醋酸也具有极强的抑制作用,0.20%的抗坏血酸即可达到90%的抑制率,0.15%的醋酸可达到83.7%的抑制率；柠檬酸和氯化钠的抑制作用较弱。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-8
第一章 绪论  8-18
  1.1 研究的背景和意义  8-9
  1.2 多酚氧化酶的研究概况和进展  9-16
    1.2.1 多酚氧化酶的分离纯化  10
    1.2.2 Bradford染色法测定蛋白含量  10-11
    1.2.3 多酚氧化酶的纯度鉴定和分子量  11-13
    1.2.4 多酚氧化酶的酶学特性  13-14
    1.2.5 多酚氧化酶的分子结构特点  14-16
  1.3 双孢蘑菇多酚氧化酶的研究现状  16-17
  1.4 课题的主要内容和意义  17-18
第二章 双孢蘑菇多酚氧化酶的提取、纯化及纯度鉴定  18-32
  2.1 前言  18
  2.2 试验材料  18-19
  2.3 试验仪器与药品  19-21
    2.3.1 主要试验仪器与设备  19
    2.3.2 试验药品  19-21
  2.4 技术路线  21
  2.5 试验方案  21-25
    2.5.1 双孢蘑菇多酚氧化酶粗酶液的制备  21
    2.5.2 粗酶液硫酸铵分级沉淀试验  21-22
    2.5.3 粗酶液的层析纯化  22-23
    2.5.4 SDS-PAGE测定PPO纯度和相对分子质量  23-24
    2.5.5 蛋白含量和活性的检测  24-25
    2.5.6 蛋白比活和纯化倍数的计算  25
    2.5.7 扫描探针显微镜观测双孢蘑菇PPO结构  25
  2.6 结果与分析  25-29
    2.6.1 PPO提纯过程中的褐变控制  25-26
    2.6.2 硫酸铵分级沉淀试验中饱和度的选择  26
    2.6.3 PPO提纯过程中的活性检测和含量测定  26-28
    2.6.4 终提取液的PPO纯度检测和相对分子质量测定  28-29
  2.7 扫描探针显微镜观测双孢蘑菇PPO结构  29-30
  2.8 讨论  30-31
  2.9 本章小结  31-32
第三章 双孢蘑菇多酚氧化酶特性的测定  32-43
  3.1 前言  32
  3.2 材料与仪器  32-33
    3.2.1 试验材料  32
    3.2.2 试验试剂  32-33
    3.2.3 主要仪器与设备  33
  3.3 试验方法  33-35
    3.3.1 PPO活性的测定  33-34
    3.3.2 pH值对PPO活性的影响及PPO最适pH值的测定  34
    3.3.3 温度对PPO活性的影响  34
    3.3.4 底物浓度与PPO活性的关系  34-35
    3.3.5 抑制剂对PPO活性及褐变的影响  35
  3.4 双孢蘑菇多酚氧化酶特性的测定  35-41
    3.4.1 pH值对PPO活性的影响  35-37
    3.4.2 底物浓度与双孢蘑菇PPO活性的关系  37-38
    3.4.3 温度对双孢蘑菇PPO相对活性的影响  38-40
    3.4.4 抑制剂对双孢蘑菇PPO活性的抑制作用  40-41
  3.5 本章小结  41-43
第四章 总结与展望  43-45
  4.1 双孢蘑菇多酚氧化酶的提取纯化  43
  4.2 双孢蘑菇多酚氧化酶的酶学特性  43-44
  4.3 总结  44
  4.4 展望  44-45
攻读硕士学位期间发表的论文及参与的课题  45-46
致谢  46-47
参考文献  47-50

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