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双孢蘑菇多酚氧化酶的研究

作　者: 吴进菊
导　师: 陈红兵
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 多酚氧化酶 双孢蘑菇 纯化 克隆 表达 交联
分类号: S646.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


双孢蘑菇营养丰富,味道鲜美。然而,双孢蘑菇在贮藏和加工过程中极容易发生褐变反应,严重地影响了产品的外观、风味、营养和加工性能,大大降低了商业价值,而多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)是引起酶促褐变的主要酶类。另外,近年来研究发现PPO能催化蛋白发生交联反应,从而可改善蛋白质的功能特性。因此,双孢蘑菇多酚氧化酶值得深入研究。本论文开展的研究工作主要包括双孢蘑菇PPO的分离纯化及酶学性质的研究、双孢蘑菇PPO对乳蛋白交联的影响、双孢蘑菇PPO新基因的克隆、PP03和PP04成熟酶基因的克隆及其在原核系统中的表达,研究的主要方法、结果及结论如下：1采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Phenyl sepharose CL-4B疏水层析相结合的方法纯化双孢蘑菇中PPO,经SDS-PAGE检测,该PPO分子量为43 kDa,N端测序得到的氨基酸序列为：Ala-Thr-Asn-Ser-Gly-Thr-Leu-Ile-Ile-Phe.2 PPO活力的最适温度和pH分别为20℃和6.5-7.0。PPO对热不稳定,当温度达到60℃时,PPO活力几乎完全丧失。Al3+可以使PPO完全失活,Cu2+和Zn2+对PPO活力表现很强的抑制作用。以邻苯二酚为底物时,PPO的Km和Vmax值分别为0.67 mmol/L和3,333 U/mLmin-1.3采用双孢蘑菇PPO对酪蛋白交联的最佳条件是PPO活力600 U/mL、pH 7、30℃反应6 h,乳清蛋白交联的最佳条件是PPO活力600U/mL、pH3-5、40℃反应4 h。交联后乳蛋白的乳化性及其稳定性和起泡性及其稳定性发生了较大的变化。另外,交联后β-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性明显降低。4通过多序列比对寻找真菌中PPO保守区的氨基酸序列,设计一对简并引物扩增保守区的基因序列,克隆获得了两个新的基因片段,然后通过RACE技术克隆获得了两个编码双孢蘑菇PPO的新基因-PPO3和PPO4. PPO3长度为1,844 bp,开放阅读框为1,731 bp,编码576个氨基酸。PPO4长度为2,042 bp,开放阅读框为1,836 bp,编码611个氨基酸。在核酸水平上,PPO3和PPO4同源性为52%,它们在Genbank数据库中的登录号分别为GQ354801和GQ354802。5通过生物信息软件和网络服务器对PPO3和PPO4的氨基酸序列、系统进化树、二级结构和三级结构进行分析,结果表明PPO3和PPO4确为编码双孢蘑菇PPO的新基因。6通过PPO3和PPO4 C-端切割位点的分析可知,PPO3成熟酶基因含有1,173 bp,编码391个氨基酸,分子量为45.3 kDa; PP04成熟酶含有1,134 bp,编码378个氨基酸,分子量为43.2 kDa。采用pGEX-4T-1表达载体和E.coli BL21 (DE3) RIPL表达菌,在原核系统中表达了PPO3和PPO4的成熟酶基因,并对其进行了纯化。得到的两种重组表达蛋白的分子量分别为71 kDa和69 kDa,均能被羊抗双孢蘑菇PPO抗体所识别。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
第1章 引言  13-30
  1.1 双孢蘑菇概况  13-14
  1.2 多酚氧化酶概况  14-21
    1.2.1 多酚氧化酶分离纯化的研究进展  14-15
    1.2.2 多酚氧化酶酶学性质的研究进展  15-17
    1.2.3 多酚氧化酶基因研究进展  17-21
    1.2.4 多酚氧化酶基因的异源表达  21
  1.3 RACE技术  21-24
    1.3.1 RACE技术的原理  22-23
    1.3.2 RACE技术的优缺点  23-24
    1.3.3 RACE技术的改良  24
  1.4 蛋白的酶交联作用  24-27
    1.4.1 转谷氨酰胺酶对蛋白的交联作用  25-26
    1.4.2 多酚氧化酶对蛋白的交联作用  26-27
  1.5 研究的目的、意义和研究内容  27-30
    1.5.1 本论文研究的目的与意义  27-28
    1.5.2 研究内容  28-30
第2章 双孢蘑菇多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究  30-46
  2.1 引言  30
  2.2 材料与设备  30-33
    2.2.1 材料与试剂  30
    2.2.2 仪器与设备  30-31
    2.2.3 溶液的配制  31-33
  2.3 实验方法  33-38
    2.3.1 原料丙酮粉的制备  33
    2.3.2 PPO粗酶液的制备  33
    2.3.3 双孢蘑菇PPO的分离纯化  33-34
    2.3.4 SDS-PAGE电泳  34-35
    2.3.5 蛋白N端测序  35
    2.3.6 双孢蘑菇PPO酶学性质的研究方法  35-36
    2.3.7 PPO活力测定  36
    2.3.8 蛋白含量测定  36-38
  2.4 结果与分析  38-44
    2.4.1 双孢蘑菇和其它食用菌、植物中PPO的活力和含量比较  38-39
    2.4.2 双孢蘑菇PPO的分离纯化效果  39-40
    2.4.3 双孢蘑菇PPO的酶学性质  40-44
  2.5 讨论  44-45
    2.5.1 双孢蘑菇PPO的分离纯化  44-45
    2.5.2 SDS-PAGE检测PPO的纯度和分子量  45
  2.6 本章小结  45-46
第3章 双孢蘑菇多酚氧化酶对乳蛋白交联的影响  46-72
  3.1 引言  46
  3.2 材料与设备  46-48
    3.2.1 材料  46
    3.2.2 主要仪器与设备  46-47
    3.2.3 溶液的配制  47-48
  3.3 实验方法  48-53
    3.3.1 酪蛋白的制备  48
    3.3.2 乳清蛋白的制备  48
    3.3.3 PPO粗酶液的制备  48
    3.3.4 PPO交联酪蛋白的实验方案  48-50
    3.3.5 PPO对乳清蛋白交联的影响实验方案  50-51
    3.3.6 蛋白乳化性及其稳定性的测定  51
    3.3.7 蛋白起泡性及其稳定性的测定  51-52
    3.3.8 交联蛋白质的抗原性评估  52
    3.3.9 PPO活力测定  52-53
    3.3.10 SDS-PAGE电泳  53
    3.3.11 蛋白含量测定  53
    3.3.12 统计学处理  53
  3.4 结果与分析  53-70
    3.4.1 双孢蘑菇PPO对酪蛋白交联的影响  53-57
    3.4.2 交联后酪蛋白功能特性的变化  57-62
    3.4.3 交联后β-酪蛋白抗原性的变化  62-64
    3.4.4 双孢蘑菇PPO对乳清蛋白交联的影响  64-67
    3.4.5 交联后乳清蛋白功能特性的变化  67
    3.4.6 交联后乳清蛋白抗原性的变化  67-70
  3.5 讨论  70
    3.5.1 PPO对乳蛋白的交联作用  70
    3.5.2 PPO交联对乳蛋白抗原性的影响  70
  3.6 本章小结  70-72
第4章 双孢蘑菇PPO新基因的克隆  72-102
  4.1 引言  72
  4.2 材料与设备  72-76
    4.2.1 原料、菌株、质粒  72-73
    4.2.2 试剂盒、工具酶、分子量Marker及主要生化试剂  73
    4.2.3 主要仪器与设备  73-74
    4.2.4 PCR引物  74
    4.2.5 常规培养基及溶液的配制  74-76
  4.3 实验方法  76-85
    4.3.1 双孢蘑菇总RNA的提取  76
    4.3.2 RNA纯度检测  76-77
    4.3.3 RT-PCR扩增PPO保守区基因片段  77-78
    4.3.4 PPO保守区新基因片段的cDNA末端快速扩增  78-81
    4.3.5 PPO新基因全长的扩增  81-82
    4.3.6 PCR产物的回收纯化  82
    4.3.7 PCR产物回收液的A尾的添加  82-83
    4.3.8 目的基因的T/A克隆、筛选和鉴定  83-84
    4.3.9 琼脂糖凝胶电泳  84
    4.3.10 DNA测序及序列分析  84-85
    4.3.11 系统进化树分析  85
  4.4 结果与分析  85-100
    4.4.1 双孢蘑菇总RNA  85-86
    4.4.2 PPO保守区基因片段  86-88
    4.4.3 PPO保守区新基因片段的cDNA 3'RACE  88-90
    4.4.4 PPO保守区新基因片段的cDNA 5'RACE  90-91
    4.4.5 PPO新基因  91-93
    4.4.6 PP03和PPO4氨基酸序列  93-94
    4.4.7 系统进化树  94-98
    4.4.8 PPO3和PPO4二级结构和三级结构预测  98-99
    4.4.9 PPO3和PPO4 C-端切割位点  99-100
  4.5 讨论  100-101
    4.5.1 简并引物的设计  100-101
    4.5.2 RACE法扩增cDNA末端  101
  4.6 本章小结  101-102
第5章 PPO3和PPO4成熟酶基因的克隆及在原核系统中的表达  102-122
  5.1 引言  102
  5.2 材料与设备  102-106
    5.2.1 菌株和质粒  102
    5.2.2 试剂盒、工具酶、分子量Marker及主要试剂  102-103
    5.2.3 主要仪器与设备  103-104
    5.2.4 PCR引物  104
    5.2.5 常规培养基及溶液的配制  104-106
  5.3 实验方法  106-113
    5.3.1 MPPO3和MPPO4基因的克隆  106-109
    5.3.2 MPPO3和MPPO4基因在大肠杆菌中的表达  109-113
  5.4 结果与分析  113-120
    5.4.1 PPO3和PPO4成熟酶基因  113-115
    5.4.2 在原核系统中表达MPPO3和MPPO4基因  115-119
    5.4.3 表达蛋白的western blotting鉴定结果  119-120
  5.5 讨论  120-121
  5.6 本章小结  121-122
第6章 结论与展望  122-124
  6.1 结论  122-123
  6.2 本研究的创新点  123
  6.3 展望  123-124
致谢  124-125
参考文献  125-133
附录A CR1碱基序列及推导的氨基酸序列  133-134
附录B CR2碱基序列及推导的氨基酸序列  134-135
附录C CR3碱基序列及推导的氨基酸序列  135-136
附录D CR4碱基序列及推导的氨基酸序列  136-137
附录E CR5与CRl的序列比对结果  137-139
附录F CR3 3'RACE测序结果  139-140
附录G CR4 3'RACE测序结果  140-141
附录H CR3 5'RACE测序结果  141-142
附录I CR4 5'RACE测序结果  142-143
附录J PPO3 cDNA序列及推导的氨基酸序列  143-145
附录K PPO4 cDNA序列及推导的氨基酸序列  145-147
附录L 重组克隆质粒pMD19-T-MPPO3测序结果  147-148
附录M 重组克隆质粒pMD19-T-MPPO4测序结果  148-149
攻读学位期间的研究成果  149

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 菌类（食用菌） > 褶伞菌
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