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猪瘟病毒RT-LAMP快速诊断试剂盒的研制与应用

作　者: 陈蕾
导　师: 王琴
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 RT-LAMP 繁殖规律 组织嗜性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 372次
引　用: 1次
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内容摘要


猪瘟又称经典猪瘟（Classical swine fever,CSF）,是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的高度致死性、接触性传染病,根据世界动物卫生组织（OIE）制定的《陆生动物卫生法典》（第血版）,CSF被列为必须报告的动物传染病之一,在我国被列为“一类动物疫病”。本研究建立了CSFV RT-LAMP快速诊断试剂盒并进行了初步的临床应用;建立了CSF急性感染动物模型,对建立的CSFV RT-LAMP方法的敏感性进行了评价,同时采用该方法分析了CSFV急性感染猪只后病毒在宿主体内的分布和组织嗜性。为在我国建立特异、敏感、快速的CSFV诊断技术,为CSF的净化和控制提供有力的技术手段,本研究探索建立了CSFV RT-LAMP快速诊断方法。将从GenBank下载的34条CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病病毒-Ⅰ（BVDV-Ⅰ）和6条BVDV-Ⅱ全序列进行综合比对,避开与BVDV同源部分,设计合成了12套CSFV的特异性引物;采用CSFV SM、BVDV、PCV、PRRSV、PCV、PPV、PRV、FMDV等8种样品的核酸进行CSFV RT-LAMP反应,筛选出一套最佳的CSFV特异性LAMP引物;提取CSFV SM的核酸作为试验的模板,系统地对Betaine、Mg2+、dNTP、Bst DNA大片段聚合酶、AMV反转录酶、引物等反应试剂的用量及温度、时间等反应条件进行了优化;将4×103.84TCID50CSFV SM血毒0.2ml提取总RNA后,按照10倍梯度稀释准备模板,同时进行RT-LAMP、FQ-PCR和RT-nPCR反应,灵敏度对比试验显示RT-LAMP灵敏度比RT-nPCR高10倍,比FQ-PCR低10倍,最低检测量达到0.32pg病毒核酸;分别采用分三次合成、经相关检验合格的CSFV RT-LAMP引物及其它试剂按照优化好的反应体系配制成三批试剂,编号分别为20080829、20080916、20081027,对制备的31个质控样本进行为期5个月的批内批间特异性、敏感性、可重复性及稳定性试验;在敏感性试验中,CSFV RT-LAMP能检出经本实验室鉴定并保存的16株CSFV毒株中的13株,表明本方法具有较好的敏感性;将本方法用于欧盟猪瘟参考实验室发放的20个盲样检测,与欧盟的FQ-PCR方法阳性符合率达到93.33%,阴性符合率达到100%,表明该方法和欧盟的FQ-PCR有很好的符合性。综合评价CSFV RT-LAMP方法的特异性、灵敏度、敏感性、符合性、可重复性和稳定性等多项指标,成功研制了CSFV RT-LAMP快速诊断试剂盒。本试剂盒无论从反应时间、试验成本还是操作步骤等方面,与目前常用的两种基因诊断方法（CSFV RT-PCR和CSFV FQ-PCR）相比,均表现出对CSFV快速诊断的优越性。为了评价上述建立的CSFV RT-LAMP方法在人工感染动物中对部分组织器官的敏感性,并且分析CSFV急性感染后病毒在宿主体内的繁殖规律、动态分布规律和组织嗜性规律,本研究采用4×103.84TCID50CSFV SM血毒0.7ml,分别肌肉注射人工感染16头60日龄长白猪,同时设立1头阴性对照,建立起CSFV急性感染动物模型。感染病程中进行体温监测和临床症状计分,感染后每天随机剖杀2头,采集颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体、脾脏、肾脏、肺、胰腺、胸腺,共计8种组织、器官样本,尿、粪便、唾液、皮肤、眼分泌物,共计5种体外样本,以及血液和血清样本,进行CSFV RT-LAMP检测。同时对采集的组织、器官进行免疫组化分析。体温监测和临床症状计分结果显示:试验用猪感染SM血毒后,随着感染时间的增加,临床症状记分迅速增加,并伴随着体温升至41℃左右,至濒死前即第7-8天,临床症状计分达最高值25分,伴随体温回落至39.5-40℃。阴性对照猪体温维持在39.5℃左右,无CSF临床症状。CSFV RT-LAMP检测结果显示:1.CSFV SM血毒感染24h后,采集的8种组织、器官均能检测出CSFV核酸;2.从感染后第1天到濒死前第8天的所有皮肤、粪便、尿液样本都能检测到CSFV阳性信号,所有的泪眼样本中都没有检测到CSFV,从感染第4天开始可在唾液样本中检测到CSFV;3.除感染后第1天的一份血液样本没有检测到CSFV核酸,其它血液样本及所有血清样本中都能检测到CSFV阳性信号;4.阴性对照猪上述采集样本均未检出CSFV核酸。免疫组化检测结果显示,CSFV抗原信号在感染24h后相继在各组织器官中检测到,初期阳性信号主要集中于毛细血管内,其后随时间逐渐弥散到毛细血管外,进入外周组织的细胞内,在胞内出现阳性信号,且信号呈现增强趋势。阴性对照猪试验期间呈健康状态,未见阳性信号。可以看到,试验猪感染后的致病特征、临床症状以及免疫组化结果等与采用CSFV RT-LAMP方法对人工急性感染后CSFV在猪体、内外繁殖规律和组织嗜性的研究结果相符合。将CSFV RT-LAMP快速诊断试剂盒用于对我国7个省市8个采样点157份临床疑似猪瘟感染病死猪的扁桃体和血液样木进行检测,同时用CSFV RT-nPCR进行符合性试验,并将RT-nPCR扩增产物测序验证,统计结果表明所有病料CSFV RT-LAMP的阳性检出率为26.11%,CSFVRT-nPCR的阳性率为14.65%,二种方法之间的符合率为85.35%。本研究建立的CSFV RT-LAMP快速诊断试剂盒不仅快速、操作简便,且灵敏度和敏感性都较CSFV RT-nPCR更好,适合临床CSF的普查和快速诊断,具有推广应用价值。同时将其应用于CSFV的繁殖规律和组织嗜性研究,为弄清CSFV的病原特性、致病机理提供了理论支持。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章 文献综述  12-25
  1.1 基因诊断技术及其在动物疾病诊断中的应用研究进展  12-17
    1.1.1 核酸分子杂交技术(Nucleic acid hybridization technique)  12-14
    1.1.2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)  14-16
    1.1.3 恒温扩增反应(Isothermal amplification)  16
    1.1.4 基因芯片技术(Gene chip technique)  16-17
    1.1.5 展望(Gene chip technique)  17
  1.2 猪瘟病毒致病性及繁殖规律研究  17-25
    1.2.1 CSFV与宿主细胞的相互关系  17-19
    1.2.2 CSFV的毒力基因  19-20
    1.2.3 CSFV引起的组织病理损伤  20-24
    1.2.4 CSFV繁殖规律  24-25
第二章 前言  25-32
  2.1 研究的目的和意义  25-26
  2.2 研究内容与技术路线  26-32
    2.2.1 研究内容  26-27
    2.2.2 主要技术路线  27-32
第三章 CSFVRT-LAMP快速诊断试剂盒的研制  32-60
  3.1 材料与方法  33-41
    3.1.1 材料  33-34
    3.1.2 方法  34-41
  3.2 结果  41-58
    3.2.1 CSFV RT-LAMP引物的筛选结果  41
    3.2.2 CSFV RT-LAMP反应体系的优化结果  41-47
    3.2.3 CSFV RT-LAMP三批试剂的制备  47
    3.2.4 CSFV RT-LAMP特异性试验结果  47-48
    3.2.5 CSFV RT-LAMP灵敏度试验结果  48-50
    3.2.6 CSFV RT-LAMP敏感性试验结果  50
    3.2.7 CSFV RT-LAMP符合性试验结果  50-51
    3.2.8 CSFV RT-LAMP三批试剂批内批间重复性、稳定性试验结果  51-56
    3.2.9 CSFV RT-LAMP快速诊断试剂盒的组装及使用说明  56-58
  3.3 讨论  58-59
  3.4 小结  59-60
第四章 猪瘟急性感染猪CSFV繁殖规律及组织嗜性研究  60-79
  4.1 材料与方法  60-66
    4.1.1 材料  60-61
    4.1.2 方法  61-66
  4.3 试验结果  66-75
    4.3.1 CSFV SM人工感染试验用猪筛选结果  66-67
    4.3.2 CSFV SM种毒TCID_(50)测定结果  67
    4.3.3 CSFV SM人工感染试验用猪临床症状监测结果  67-69
    4.3.4 CSFV SM株人工感染试验用猪核酸样本检测结果  69-72
    4.3.5 CSFV SM株人工感染试验用猪组织器官病理学观察结果  72-73
    4.3.6 CSFV SM人工感染猪组织器官免疫组化检测结果  73-75
  4.4 讨论  75-78
    4.4.1 CSFV核酸和抗原蛋白检测的相关性  75-76
    4.4.2 CSFV的体内分布  76-77
    4.4.3 CSFV的排毒与传播  77
    4.4.4 几种检测方法的对比  77-78
  4.5 小结  78-79
第五章 CSFVRT-LAMP 方法在临床诊断中的应用  79-83
  5.1 材料和方法  79-80
    5.1.1 材料  79-80
    5.1.2 方法  80
  5.2 结果  80-81
    5.2.1 CSFV RT-LAMP方法对我国部分地区CSF可疑样品的检测  80-81
    5.2.2 CSFV RT-nPCR方法对我国部分地区CSF可疑样品的符合试验  81
    5.2.3 实验统计结果  81
  5.3 讨论  81-82
  5.4 小结  82-83
第六章 结论与创新  83-84
  6.1 结论  83
  6.2 创新点  83-84
第七章 下一步工作设想  84-86
参考文献  86-90
致谢  90-91
附录  91-94
作者简介  94

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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