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猪瘟是猪的重要传染病之一,给养猪业造成严重的经济损失,被世界卫生组织列为A类动物烈性传染病之一,加强对猪瘟病毒研究显得尤为重要。控制猪瘟最有效的方法是注射疫苗,目前最常用的疫苗为减毒疫苗。中国C株在我国控制猪瘟传播上发挥重要作用,并被国外广泛应用,是公认的安全有效的疫苗。猪瘟病毒全基因组包括5端和3端非编码区,中间是一个大的阅读框,编码12种蛋白。5端非编码区包含一个内部核糖体进入位点(IRES),通过与宿主核糖体的配对,起始病毒的翻译。猪瘟病毒中国C株在猪细胞中的复制效率很低,其原因可能很复杂,具体机制尚不清楚,我们推测病毒滴度的高低与其翻译水平有一定的联系,而猪瘟病毒决定翻译的主要是5端非编码区上的IRES,因此我们比较石门株和C株对病毒翻译的影响。本实验室保存的质粒pEGFP-N3-FR,包含巨细胞病毒CMV强启动子控制下的Rluc报告基因及CSFV S株的IRES控制下的Fluc报告基因,以弱毒C株IRES取代强毒Shimen株的IRES,获得重组质粒pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR。通过比较二者调控下的荧光素酶报告基因的表达情况,了解IRES对C株病毒翻译的影响。研究发现实验组pEGFP-N3-FR及pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR的萤火虫荧光素酶活性差异不显著,表明兔化毒株的低翻译效率可能不是IRES差异造成的。猪瘟病毒反向遗传系统目前主要的方法还是体外转录,即转录由启动子起始,转录过程由终止子终止,产物mRNA转染到细胞中翻译蛋白。但由于产生的RNA易降解,不利于转染的进行。本研究设计细胞内转录系统,将T7 RNA聚合酶表达质粒转染PK-15细胞,避免了体外转录的操作。T7 RNA聚合酶能严格、特异地识别T7启动子,高效转录mRNA。本研究是以E coli. BL21基因组为模板,通过PCR获得T7 RNA聚合酶基因,经测序确定无移码突变后,最终克隆到真核表达载体pEGFP-N3启动子CMV的下游,获得含T7 RNA聚合酶的真核表达载体。并与含T7启动子控制下的的重组质粒同时转染到猪肾细胞PK-15中,通过检测GFP基因的表达情况,确定T7 RNA聚合酶的偶联表达。结果发现表达绿色荧光蛋白的细胞数目较低,可见视野内仅有几个细胞表达,已经证明T7 RNA聚合酶的偶联表达,建立T7 RNA聚合酶表达系统,为下一步CSFV体内转录打下基础。质粒的稳定性包括分离的稳定性和结构的稳定性。重组质粒在传代的过程中由于受外界条件的影响,易发生基因序列的突变,甚至是质粒的丢失。提高质粒的稳定性在遗传工程研究和生产中显得很重要。本研究将质粒pMC18-CSFV-C株全基因进行测序,与我们实验室以前测得的序列AY382481比对后,发现质粒上C株cDNA有若干个位点发生突变。说明质粒在保存及扩增的过程中发生了一定程度的突变。为了控制猪瘟的传播,了解全国乃至世界猪瘟的进化情况,掌握猪瘟流行的种群动态,对预防猪瘟有着不可替代的作用。另外,疫苗接种对预防猪瘟传播起了重要作用,但疫苗接种对猪瘟病毒群体进化的影响尚没有相关报道。本研究收集中国可利用的猪瘟病毒基因组序列,经过分析发现同源重组对猪瘟病毒遗传多样性发挥作用。猪瘟病毒种群动态分析显示疫苗组与非疫苗组种群进化速率及种群不同,说明接种对猪瘟病毒种群进化有影响。
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