学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立

作　者: 张兴娟
导　师: 石火英；仇华吉
学　校: 扬州大学
专　业: 病理学与免疫学
关键词: 猪瘟病毒猪瘟兔化弱毒疫苗三重荧光定量RT-PCR TaqMan探针鉴别诊断
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 180次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(HCV或CSFV)引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE名录,我国将其列为一类传染病。其基因组为单股正链RNA,大小约为12.3 kb,含有1个大的开放阅读框(ORF),两侧为高度保守的5′和3′非编码区(UTR)。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和CSFV同为黄病毒科瘟病毒属成员,根据BVDV基因组的差异,我们将其分为两个基因型,即基因型1(BVDV-1)和基因型2(BVDV-2)。同属的成员还包括:绵羊边界病病毒(BDV)和长颈鹿瘟病毒(Pestivirus of Giraffe)。由于BVDV不仅可以感染牛还可以感染猪,引起与猪瘟相似的临床症状和病理变化,同时BVDV与CSFV存在血清学交叉反应,因此很容易被误诊为猪瘟。此外,猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我国的大规模应用,使猪瘟野毒感染、疫苗接种的区分变得非常困难和必要。因此,亟待建立一种可以准确区分猪瘟野毒感染、疫苗接种以及BVDV感染的快速、高效、敏感而特异的检测方法。本研究旨在建立一种能同时区分CSFV野毒、HCLV和BVDV-1的敏感、特异、重复性好的三重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。根据CSFV NS5B区域分别设计了针对CSFV野毒、HCLV的引物和TaqMan水解探针,依据BVDV 5′-UTR设计了一对针对BVDV-1的引物和TaqMan水解探针,在优化反应条件的基础上,建立了同时区分CSFV、HCLV和BVDV-1的三重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSFV野毒株、HCLV以及BVDV-1完全区分开来,而不与其它猪源病毒发生非特异反应,在107-101拷贝/μL范围内,对CSFV、HCLV和BVDV标准品模板的检测具有良好的线性关系,最低检测限分别为4.5 TCID50(CSFV野毒)、7.8个拷贝(HCLV)或3.2 TCID50(BVDV-1)。用本方法与实验室建立的RT-nPCR、鉴别猪瘟野毒和弱毒的荧光定量RT-PCR和检测BVDV-1的RT-PCR方法分别对176份临床样品72份HCLV疫苗进行检测,符合率均达到了97.0%以上。本方法可以同时定量检测和区分三种病毒,用于现地疑似猪瘟病料、商品化牛血清的检测,同时还可以对猪瘟疫苗的质量进行监控。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
符号说明  10-11
第一章引言  11-36
  1.1 瘟病毒概述  11-24
    1.1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述  11-12
    1.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗概述  12-14
    1.1.3 BVDV 概述  14-16
    1.1.4 瘟病毒基因组结构及其功能  16-18
    1.1.5 瘟病毒基因组编码的蛋白及其功能  18-22
    1.1.6 猪瘟病毒的遗传分型  22-23
    1.1.7 BVDV 的遗传分型  23-24
  1.2 瘟病毒的诊断方法和研究现状  24-30
    1.2.1 病毒的分离与鉴定  25
    1.2.2 血清学诊断  25
    1.2.3 免疫学诊断  25-26
    1.2.4 分子生物学诊断技术  26-28
    1.2.5 鉴别检测技术  28-30
  1.3 荧光定量 PCR  30-34
    1.3.1 荧光定量PCR 原理  30
    1.3.2 荧光定量PCR 的定量形式  30-31
    1.3.3 荧光定量PCR 的分类  31-33
    1.3.4 多重荧光定量 PCR 及其在病毒研究上的应用  33-34
  1.4 本研究的目的和意义  34-36
第二章同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1 型的三重荧光定量 RT-PCR 方法的建立  36-55
  2.1 材料和方法  38-45
    2.1.1 病毒  38-39
    2.1.2 主要实验仪器及试剂  39-40
    2.1.3 引物和探针  40
    2.1.4 病毒RNA 的提取和反转录  40-42
    2.1.5 三重荧光定量RT-PCR 阳性标准品的制备  42
    2.1.6 三重荧光定量RT-PCR 反应条件的优化  42
    2.1.7 特异性试验  42-43
    2.1.8 敏感性试验  43
    2.1.9 重复性试验  43
    2.1.10 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率试验  43
    2.1.11 病毒分离的验证  43-44
    2.1.12 三重荧光定量 RT-PCR 对现地样品的检测和种系发生分析  44-45
  2.2 结果  45-52
    2.2.1 三重荧光定量RT-PCR 标准曲线的建立  45-47
    2.2.2 三重荧光定量RT-PCR 的特异性  47-48
    2.2.3 三重荧光定量RT-PCR 的敏感性  48
    2.2.4 三重荧光定量RT-PCR 的重复性  48-49
    2.2.5 病毒分离的验证结果  49-50
    2.2.6 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率  50-51
    2.2.7 种系发生分析  51-52
  2.3 讨论  52-55
第三章总结  55-56
参考文献  56-70
致谢  70-72
攻读学位期间发表的学术论文目录  72

同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立

内容摘要

全文目录

相似论文