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东亚三角涡虫DjRhoA基因的表达及功能分析

作　者: 聂敏
导　师: 赵博生
学　校: 山东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 东亚三角涡虫 DjRhoA基因 干细胞 神经系统 再生
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 39次
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内容摘要


Rho家族(Ras-homologous)是Ras超家族中的一员,编码的蛋白为GTP结合蛋白并具有GTP酶活性,简称小G蛋白。RhoA蛋白是Rho家族中研究较多的一种,大量研究表明其参与多种信号通路,在信号转导中起分子开关的作用,RhoA蛋白在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环,与GDP结合时游离于细胞浆中,与GTP结合时则作用于细胞内的效应因子。通过其参与的不同信号通路,调节多种细胞生命过程,其中包括细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂、细胞极性、基因转录、胚胎发育以及细胞凋亡等。然而RhoA(?)在处于特殊进化地位的涡虫中却没有报道,本文利用整体原位杂交、荧光免疫组织化学及RNA干扰等分子生物学技术,研究了在成虫、再生涡虫及胚胎发育过程中RhoA表达情况及涡虫中RhoA基因的功能。在胚胎发育过程中RhoA基因主要在胚胎咽、胚带、咽原基及原始神经细胞中表达,在再生过程中RhoA阳性信号集中在再生胚基,当涡虫胚胎发育至幼虫、涡虫再生完全及成虫中信号都定位在中枢神经系统。利用RNA干扰技术将RhoA沉默掉,涡虫头部神经节异常、部分涡虫不能完全再生及出现凋亡现象。这表明在涡虫中RhoA基因参与了神经系统结构的维持并与组织分化有关。综合实验结果,在再生过程中RhoA基因在胚基表达及干扰后涡虫不能完全再生并出现凋亡现象,我们推测该基因与涡虫干细胞增殖有关。在胚胎发育过程及成虫中RhoA基因在神经细胞中表达,RhoA蛋白定位在中枢神经系统,干扰后涡虫头部神经节异常,这表明该基因参与了涡虫神经系统结构的维持,但对于它们的分子机制仍需进一步实验进行验证。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
缩略语  5-6
目录  6-9
第一章 文献综述  9-22
  1. 涡虫研究进展  9-16
    1.1 涡虫的进化地位  9
    1.2 涡虫的繁殖与胚胎发育  9-11
    1.3 涡虫再生与干细胞  11-14
    1.4 涡虫的神经系统  14-16
    1.5 涡虫的细胞凋亡  16
  2. RhoA研究进展  16-20
    2.1 Ras超家族简介  16-17
    2.2 Rho家族简介  17
    2.3 RhoA简介  17-18
    2.4 RhoA的功能  18-20
  3. 研究意义与技术路线  20-22
    3.1 研究意义  20
    3.2 主要内容  20-22
第二章 RhoA基因的进化及生物信息学分析  22-37
  1. 前言  22
  2 实验材料和方法  22-26
    2.1 材料  22-23
    2.2 实验方法  23-26
  3. 结果  26-36
    3.1 涡虫DjRhoA基因的序列分析  26-28
    3.2 Rho家族进化树的构建  28-29
    3.3 RhoA蛋白序列比较与系统进化分析  29-34
    3.4 东亚三角涡虫DjRhoA基因基因组分析  34-36
  4. 讨论  36-37
第三章 东亚三角涡虫DjRhoA基因的表达分析  37-57
  1. 前言  37
  2. 材料和方法  37-46
    2.1 实验材料  37-38
    2.2 实验方法  38-46
  3. 结果  46-56
    3.1 DjRhoA与pcDNA3载体的连接  46-47
    3.2 DjRhoA探针的合成  47-49
    3.3 涡虫RhoA基因Northern杂交  49-50
    3.4 涡虫胚胎整体原位杂交结果  50-52
    3.5 再生涡虫整体原位杂交结果  52-53
    3.6 涡虫再生过程中DjRhoA基因表达量检测  53-56
  4. 讨论  56-57
第四章 东亚三角涡虫DjRhoA蛋白的原核表达及组织定位  57-65
  1. 前言  57
  2. 材料和方法  57-59
    2.1 材料  57
    2.2 方法  57-59
  3. 结果  59-63
    3.1 PCR扩增得到含有Xho Ⅰ酶和Xba Ⅰ酶酶切位点的RhoA基因片段  59-60
    3.2 重组质粒pBV220-IL1-RhoA菌液PCR鉴定及测序  60-61
    3.3 重组蛋白的表达  61
    3.4 重组蛋白的纯化及Western杂交鉴定  61-62
    3.5 荧光免疫组织化学定位  62-63
  4 讨论  63-65
第五章 东亚三角涡虫DjRhoA基因的功能分析  65-76
  1. 前言  65
  2. 材料和方法  65-68
    2.1 实验材料  65
    2.2 实验方法  65-68
  3. 结果  68-75
    3.1 PCR扩增得到含Xba Ⅰ酶和Kpn Ⅰ酶酶切位点的RhoA基因片段  68
    3.2 重组质粒L4440-DjRhoA菌液PCR鉴定及测序  68-69
    3.3 干扰后DjRhoA基因表达量检测  69-71
    3.4 干扰后涡虫表型改变  71-74
    3.5 RhoA 干扰后涡虫外观形态异常  74-75
  4. 讨论  75-76
结论  76-77
参考文献  77-83
致谢  83-84
附录  84-86

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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