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IBR间接ELISA的建立及重组gE糖蛋白与单抗的研制

作　者: 王海燕
导　师: 韩文瑜
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛传染性鼻气管炎牛疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白E 克隆与表达酶联免疫吸附试验单抗
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

以牛肾细胞系(MDBK)培养牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。以IBRV Bartha Nu/67株的DNA作为模板,分六段扩增编码糖蛋白E的基因,并克隆至pET32a表达载体中。在大肠杆菌中进行表达,其中两个为可溶性重组蛋白pET32gEE和pET32gEB。重组蛋白纯化后,经免疫印迹试验和间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。以重组蛋白pET32gEE为诊断抗原成功建立了检测gE抗体的间接ELISA诊断方法。应用IBRV全病毒及gE-ELISA诊断方法分别检查了我国部分地区的牛血清,结果这些地区的IBRV感染率分别为67.10%和68.74%。用纯化的IBRV、重组pET32gEE和pET32gEB蛋白为免疫原,分别免疫Balb/C小鼠,通过杂交瘤技术获得了3株分泌抗IBRV单克隆抗体(McAb )的杂交瘤细胞;2株分泌抗gEE单克隆抗体的杂交瘤细胞和2株分泌抗gEB单克隆抗体的杂交瘤细胞。这些单克隆抗体用双抗体夹心ELISA试验可区别IBRV阳性血清与阴性血清;同时gEE单抗和gEB单抗可初步区别gE缺失株和gE非缺失株。

全文目录

前言  11-13
第一篇文献综述  13-63
  第一章牛传染性鼻气管炎病毒的研究概况  13-29
    1 牛传染性鼻气管炎病毒概述  13-24
    2 牛传染性鼻气管炎病毒的分子生物学研究进展  24-29
  第二章牛传染性鼻气管炎病毒主要糖蛋白及gE 基因研究进展  29-43
    1 IBRV 主要糖蛋白的研究进展  29-36
    2 IBRV 糖蛋白gE 基因及其研究进展  36-43
  第三章牛传染性鼻气管炎的诊断  43-63
    1 病原学诊断  43-45
    2 血清学诊断  45-48
    3 鉴别诊断  48-63
第二篇研究报告  63-137
  第一章牛传染性鼻气管炎间接 ELISA 诊断方法的建立  63-77
    1 材料与方法  64-67
      1.1 材料  64
      1.2 方法  64-67
    2 结果  67-75
      2.1 抗原和兔抗牛 IgG 辣根过氧化物酶标抗体最佳稀释度的确定  67
      2.2 阴﹑阳性血清最佳稀释度的确定  67-68
      2.3 底物最佳作用时间的确定  68-69
      2.4 特异性试验  69
      2.5 重复性试验  69-70
      2.6 判定标准的确定  70-72
      2.7 对比试验  72-75
      2.8 ELISA 诊断方法的初步应用  75
    3 讨论  75-77
  第二章牛传染性鼻气管炎病毒gE 基因的克隆表达与鉴定  77-95
    1 材料与方法  78-85
      1.1 材料  78-79
      1.2 方法  79-85
    2 结果  85-92
      2.1 糖蛋白gE 基因各片段的扩增与克隆  85-87
      2.2 糖蛋白gE 基因各片段的表达  87-89
      2.3 重组蛋白gEB、gEE 的纯化  89-90
      2.4 免疫印迹结果  90-92
    3 讨论  92-95
  第三章牛传染性鼻气管炎病毒重组gE 蛋白间接 ELISA 诊断方法的建立  95-107
    1 材料与方法  96-99
      1.1 材料  96
      1.2 方法  96-99
    2 结果  99-104
      2.1 重组抗原的制备  99
      2.2 抗原和兔抗牛IgG 辣根过氧化物酶标抗体最佳稀释度的确定  99-100
      2.3 阴﹑阳性血清最佳稀释度的确定  100
      2.4 底物最佳作用时间的确定  100-101
      2.5 pET32a 空载体表达蛋白与血清样品阻断浓度的确定  101
      2.6 特异性试验  101-102
      2.7 重复性试验  102
      2.8 判定标准的确定  102
      2.9 对比试验  102-104
      2.10 ELISA 诊断方法的初步应用  104
    3 讨论  104-107
  第四章牛传染性鼻气管炎病毒及其gE 蛋白单克隆抗体的制备及应用  107-137
    1 材料与方法  108-118
      1.1 材料  108-109
      1.2 方法  109-118
    2 结果  118-129
      2.1 免疫抗原的制备  118-119
      2.2 免疫小鼠血清抗体效价的测定  119-120
      2.3 细胞融合  120
      2.4 杂交瘤细胞的筛选  120-122
      2.5 小鼠腹水效价的测定  122-123
      2.6 杂交瘤细胞染色体数的检测  123-125
      2.7 抗体亚类的测定结果  125-126
      2.8 中和试验  126
      2.9 免疫荧光试验  126-127
      2.10 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定  127-128
      2.11 单克隆抗体的初步应用  128-129
    3 讨论  129-137
结论  137-139
参考文献  139-157
攻博期间发表的学术论文  157-158
中文摘要  158-161
英文摘要  161-166
导师及作者简介  166-167
致谢  167

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