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大麦黄矮病毒三种株系的特异性检测及PAV株系的群体遗传变异

作　者: 刘双清
导　师: 高必达；王锡锋
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大麦黄矮病毒地高辛cDNA探针点杂交 RT-PCR 系统进化树遗传变异
分类号: S435.123
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 32次
引　用: 3次
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内容摘要

大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是引起我国麦类病毒病的主要病毒之一,可造成巨大经济损失。本研究以采集自我国不同小麦种植区的大麦黄矮病株样品为材料,进行病毒三种株系的特异性检测鉴定、蚜传分离,明确不同地区的病毒株系分布、优势种类和动态变化,以及PAV株系的群体遗传变异及进化关系。2007年根据田间症状,在我国四个农业生态区(西北地区、北方地区、中部地区和西南地区)共采集BYDVs样品281份,设计了特异性检测三种病毒株系(BYDV-GAV、BYDV-PAV、BYDV-GPV)的地高辛探针,探针对应病毒株系基因组CP基因与RTP基因,核酸点杂交检测结果表明,GAV、GPV和PAV三种探针能够检测到带毒植物组织的下限分别为25 ug,31.25 ug,62.5 ug,总共有190份样品(占67.6%)鉴定为阳性,其中检测到118份GAV(占41.99%)、54份PAV(占19.22%)、18份GPV(占6.41%),有少数样品还检测到了几种病毒株系混合侵染。GAV占据了田间侵染的大部分比例,是我国目前大麦黄矮病毒的主流株系,在焦作、大同、银川和乌鲁木齐地区普遍发生。PAV和GPV在特定区域呈优势发生,PAV主要分布在洛阳、郑州、天水等地区,GPV在田间侵染较少,在陕西韩城、山西运城零星发生。总体来看,我国麦区黄矮病发病率比较严重,不同地区麦蚜传播同一株系有差异,麦蚜带毒与传毒效率高低直接影响病害流行。设计了扩增GAV株系、PAV株系CP基因的特异性引物,RT-PCR扩增后克隆测序,将各地样品的CP基因进行序列比对,分析了不同病毒株系的分子变异。测序的11个GAV CP基因均为600 bp,序列保守,系统进化树没有明显聚类。测序的10个PAV CP基因有600 bp和603 bp两种类型,变异程度明显,共有179个位点发生变异,尤其表现在3’末端,系统进化树形成三个组(A、B、C)。A、B两组来自同一进化分支,同属于PAV-CN分离物,CP基因均为600 bp,但序列间差异程度较大,各自聚类成组;样品05GG2和06KM25的CP基因核苷酸为603 bp,聚类成C组,与国外PAV分离物PAV-AUS的序列相似性达93.6%以上。在大麦黄矮病毒的不同株系中,PAV株系的中国分离物比较特殊。根据GenBank已报道的PAV全基因组序列设计保守引物,经点杂交、RT-PCR鉴定和蚜传生物学分离,克隆测定了有代表性的30个PAV分离物,病毒基因组核苷酸全长为5652-5709 nt(GenBank登录号EU332307-EU332336),核苷酸序列相似性75.1%-99.7%,所编码的RdRp相似性82.2%-99.8%,CP相似性72.3%-99.6%,MP相似性77.6%-99.7%,RTP相似性77.4%-99.7%。中国与世界各地的PAV分离物用分子生物学软件DNAMAN和MEGA构建系统发育树表明,中国PAV至少存在四种群体类型,以PAV-CN为主,是我国PAV的优势类群;另外存在以样品05GG2、06KM14、06KM25、06GY1、06GY5为代表的特殊分离物,它们与PAV-CN核苷酸差异较大(相似性仅为78.5%),ORF和UTR均与国外PAV相似性高(93.6%以上),聚类成簇明显,这表明来自甘肃甘谷、云南昆明和贵州贵阳地区的PAV群体的遗传进化关系复杂特殊,这可能与当地地理环境、气候条件、植物寄主或蚜虫种群有关。地理位置及聚类分析结果表明,我国BYDV-PAV群体遗传多样性丰富,经生物信息学推测,病毒种群处于稳定进化状态,PAV可能起源于西北地区的甘肃、陕西一带,其传播扩散路线可能为:自20世纪60年代在中国甘肃、陕西一带出现后,逐渐向我国北部、东部、中部和南部传播扩散。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-24
  1.1 大麦黄矮病毒的生物学特性  11-14
  1.2 大麦黄矮病毒的分子生物学特性  14-16
  1.3 植物病毒的检测方法  16-17
  1.4 植物病毒的分子群体遗传学  17-20
  1.5 植物病毒分子群体遗传学的研究方法  20-22
  1.6 本研究的目的和意义  22-23
  1.7 本研究的技术路线  23-24
第二章地高辛标记的cDNA探针检测大麦黄矮病毒三种株系及流行规律分析  24-36
  2.1 材料与方法  24-31
    2.1.1 田间样品的采集  24
    2.1.2 试剂和酶类  24
    2.1.3 病毒RNA的提取  24-25
    2.1.4 提取的RNA含量测定  25
    2.1.5 引物的设计与合成  25
    2.1.6 RT-PCR扩增  25-26
    2.1.7 DNA片段的回收纯化  26-27
    2.1.8 大肠杆菌感受态细胞的制备  27
    2.1.9 目的片段与克隆载体连接  27
    2.1.10 连接产物转化感受态细胞  27-28
    2.1.11 重组克隆的菌落PCR鉴定  28
    2.1.12 重组克隆的酶切鉴定  28-29
    2.1.13 地高辛标记的探针制备  29
    2.1.14 点杂交  29-31
  2.2 结果与分析  31-35
    2.2.1 RT-PCR扩增结果  31
    2.2.2 地高辛探针的获得  31-32
    2.2.3 地高辛探针的特异性与灵敏性  32-33
    2.2.4 点杂交检测田间小麦样品  33-34
    2.2.5 BYDV株系的分布与流行  34-35
  2.3 讨论  35-36
第三章大麦黄矮病毒GAV株系、PAV株系CP基因的序列分析  36-44
  3.1 材料与方法  36-37
    3.1.1 田间样品的采集  36
    3.1.2 试剂和酶类  36
    3.1.3 载体与菌株  36
    3.1.4 引物设计  36
    3.1.5 生物学验证与蚜传分离  36-37
    3.1.6 RT-PCR及其产物的克隆和鉴定  37
    3.1.7 DNA序列测定及分析  37
  3.2 结果与分析  37-43
    3.2.1 蚜传生物学测定结果  37-38
    3.2.2 RT-PCR结果  38-39
    3.2.3 BYDV-GAV CP基因序列测定及比较分析  39-41
    3.2.4 BYDV-PAV CP基因序列测定及比较分析  41-43
  3.3 讨论  43-44
第四章大麦黄矮病毒PAV株系的群体遗传变异  44-54
  4.1 材料与方法  44-46
    4.1.1 酶与试剂  44
    4.1.2 田间样品的采集与来源  44
    4.1.3 生物学验证与蚜传分离  44
    4.1.4 基因组克隆与序列测定  44-45
    4.1.5 群体遗传变异与选择压力分析  45
    4.1.6 系统进化分析与传播途径推测  45-46
  4.2 结果与分析  46-51
    4.2.1 生物学验证与蚜传分离结果  46-47
    4.2.2 RT-PCR检测与鉴定  47
    4.2.3 基因组克隆与序列分析  47-48
    4.2.4 病毒群体在选择压力下的进化模式分析  48-49
    4.2.5 群体遗传变异与系统进化分析  49-51
    4.2.6 群体遗传多样性分析  51
    4.2.7 BYDV-PAV在我国的起源与传播扩散路径推测  51
  4.3 讨论  51-54
    4.3.1 我国BYDV-PAV群体符合准种遗传结构特征  51-52
    4.3.2 病毒遗传多样性和基因功能间的关系  52
    4.3.3 我国BYDV-PAV群体具有复杂的遗传结构  52-53
    4.3.4 病毒遗传进化分析中揭示的分子流行病学规律  53-54
参考文献  54-59
附录1 本研究使用的试剂和溶液的配制  59-60
附录2 本研究使用的实验仪器  60-61
附录3 BYDV-GAV株系的CP基因序列比对结果  61-65
附录4 BYDV-PAV株系的CP基因序列比对结果  65-69
附录5 本研究在Genbank中的登录的BYDV-PAV序列  69-70
附录6 本研究引用的用于序列比对与聚类分析的相关序列  70-71
缩略词表  71-72
致谢  72-73
作者简历  73

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