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小麦黄矮病防治关键技术及其新型病毒抑制剂的研究

作　者: 张文斌
导　师: 安德荣
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 小麦黄矮病大麦黄矮病毒GAV株系农药防治效果 siRNA
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
引　用: 1次
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内容摘要

小麦黄矮病(Wheat yellow dwarf)是我国重要的植物病毒病之一,由麦蚜传播大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)引起,导致小麦严重减产。为防治小麦黄矮病,选育抗BYDV品种是最经济有效的方法,但栽培品种中抗BYDV基因贫乏,常规育种周期长、定向性差、易带入不良性状;化学防治也是控制小麦黄矮病的主要途径之一,但主要以杀虫剂控制蚜虫为主,而且麦蚜难以准确预报。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是将与内源性mRNA编码区序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)作为RNAi途径的重要中介,能够高效抑制病毒复制;阻断相应的病毒粘附受体的表达,切断病毒侵染途径;而且小干扰RNA介导的抗病毒效应具有高度特异性,对非同源基因的表达没有影响,已被广泛应用于哺乳动物和人细胞体系中基因功能和抗病毒研究。为防治小麦黄矮病及制备新型病毒抑制剂,本试验进行了如下研究:1.采用病毒抑制剂和杀虫剂相结合的方式进行了小麦黄矮病的田间药效试验。在小麦起身期,将大麦黄矮病毒GAV株系接种于陕恳9740上,喷施杀虫剂(2000倍液2.5%吡虫啉可湿性粉剂)与病毒抑制剂(500倍液20%病毒A可湿性粉剂、500倍液3.95%病毒必克可湿性粉剂、500倍液5%菌毒清水剂和300倍液2%菌克毒克水剂)组合后,于小麦开花期,统计发病率、病情指数和小麦叶片黄化率,结果表明,各组合均能早期预防和防治小麦黄矮病发生和发展,且预防效果优于防治效果,其中病毒必克与吡虫啉组合的平均预防和防治效果较显著,分别为58.08%和53.03%;2.初步研究了病毒必克对BYDV的作用机制。利用500倍液3.95%病毒必克可湿性粉剂,在室内进行的防治性试验,选用分析纯丙酮和分析纯乙醇混合液(2:1)浸泡提取叶绿素,测量叶绿素后发现,病毒必克可有效抑制GAV对叶绿素的破坏,可减轻大麦黄矮病毒对小麦的为害。3.初步制备了靶向BYDV-GAV株系依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和外壳蛋白(Coat protein, CP)的生物制剂。依据BYDV-GAV基因组全序列,设计并合成了siRNA的寡核苷酸序列,与含有转移DNA(Transferred-DNA, T-DNA)整合必需序列、卡那霉素抗性选择标记基因(nptⅡ)和35S启动子的双元表达载体pBI121连接,构建了重组表达载体pBI/siRNA,转至大肠杆菌鉴定繁殖后,再转至根癌农杆菌中,经电泳鉴定,质粒pBI/siRNA已转到根癌农杆菌中,表明得到了可能对BYDV-GAV有干扰作用的菌株。再将该菌株28℃在LB培养基上(含50μg/ml卡那霉素)过夜培养后,所得菌丝配置后,制成了可能对BYDV-GAV有干扰作用的生物制剂。采用病毒抑制剂和杀虫剂相结合的施药方式,有望广泛应用于由昆虫介体传播的植物病毒病的防治中;利用DNA重组技术,能获得对病毒有抑制作用的改良微生物,通过液体或固体发酵,可进行规模化生产,有助于植物病毒病的防治。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 小麦黄矮病的发生及为害  11-12
  1.2 病原大麦黄矮病毒  12-13
  1.3 麦蚜传毒过程  13-14
  1.4 小麦黄矮病的流行  14
  1.5 小麦黄矮病的综合防治  14-19
    1.5.1 大麦黄矮病毒的鉴定与诊断  15
    1.5.2 麦蚜和小麦黄矮病的预测预报  15-17
    1.5.3 筛选、培育和鉴定抗病品种  17-18
    1.5.4 麦蚜的生物防治  18
    1.5.5 小麦黄矮病的农业防治  18
    1.5.6 小麦黄矮病的化学防治  18-19
  1.6 抗病毒物质研究进展  19-23
    1.6.1 抗病毒物质种类  19-21
    1.6.2 抗病毒物质的作用机理  21-23
  1.7 RNA 干扰在植物抗病毒中的应用  23-24
  1.8 本研究目的和意义  24-26
第二章几种药剂对小麦黄矮病防治效果的研究  26-31
  2.1 材料与方法  26-28
    2.1.1 供试农药  26
    2.1.2 田间小区设计与播种  26
    2.1.3 毒源繁殖与接种  26
    2.1.4 田间药效处理设计  26-27
    2.1.5 田间调查  27
    2.1.6 室内叶绿素含量的测定  27-28
  2.2 结果与分析  28-29
    2.2.1 田间药效试验  28-29
    2.2.2 室内叶绿素含量测定  29
  2.3 讨论  29-31
第三章一种含有同源于BYDV-GAV 小干扰RNA 抑制剂的研究  31-37
  3.1 材料与方法  31-34
    3.1.1 材料  31-32
    3.1.2 试验方法  32-34
  3.2 结果与分析  34-36
    3.2.1 设计合成的寡核苷酸序列  34
    3.2.2 双元载体 pBI121 酶切线性化  34-35
    3.2.3 siRNA 重组表达载体构建  35
    3.2.4 连接产物转化感受态大肠杆菌TG1  35-36
    3.2.5 转化根癌农杆菌EHA105 菌株  36
  3.3 讨论  36-37
第四章结论  37-38
参考文献  38-44
附录  44-46
致谢  46-47
作者简介  47

小麦黄矮病防治关键技术及其新型病毒抑制剂的研究

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