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琥珀酸工程菌的发酵优化及E.coli TUQ13中心碳代谢的~（13）C通量分析

作　者: 刘子鹤
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: yfiD ldhA ptsG ackpta GC-MS 代谢通量分析大肠杆菌
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本篇论文主要涉及以下两个方面:在菌种的优化发酵方面,本文采用复合培养基,分别对大肠杆菌 ptsG敲除株TUQ2、大肠杆菌ptsG, ackpta双敲除株TUQ17这两株大肠杆菌产琥珀酸工程菌进行厌氧的批发酵以及流加补糖发酵。首先,对大肠杆菌TUQ2进行厌氧流加发酵优化实验,得到琥珀酸的产量最高达37.442 g/L,得率可达0.86mol/mol glu。其次,对TUQ2和TUQ17进行厌氧批发酵的优化,在两种调节pH方式种选择利用发酵罐自动补充NaOH调节pH值,该实验条件下琥珀酸产量可达30.626 g/L。发酵结果表明TUQ17虽能降低副产物乙酸形成,但并未提高琥珀酸的产量,仅为20.26g/L,多于的碳流生成乳酸,乳酸产量为44.163g/L。在~13)C代谢通量分析方面,本文采用气质连用(GC-MS)的定量分析手段,通过对~13)C标记的中间代谢产物标记状态的定量分析,对大肠杆菌TUQ13的中心碳代谢网络通量进行确定。实验结果如下:在大肠杆菌TUQ13的中心碳代谢网络中,有35%的通量流向琥珀酸,相对于野生型的13.3%及大肠杆菌TUQ12的6.7%有很大的提高;有0.9%的通量流向乳酸,验证是TUQ13敲除编码乳酸脱氢酶的基因ldhA实验成功;有22%的通量流向了PP途径,降低了厌氧条件下产NADH的主要途径EMP的通量,而因为大肠杆菌产琥珀酸需要消耗大量了NADH,因此确定下一步的基因靶点为编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
前言  7-8
第一章文献综述  8-28
  1.1 琥珀酸的研究近况  8-11
    1.1.1 琥珀酸的性质及用途  8
    1.1.2 大肠杆菌产琥珀酸的机理  8-9
    1.1.3 大肠杆菌产琥珀酸的研究现状  9-11
  1.2 菌种的介绍  11-16
    1.2.1 大肠杆菌TUQ2 的菌种介绍  11-13
    1.2.2 TUQ13 的菌种介绍  13-16
  1.3 ~(13)C标记代谢通量分析产生的背景及研究现状  16-19
  1.4 ~(13)C 标记实验的原理与方法  19-21
  1.5 ~(13)C标记实验的测试平台及对~(13)C标记实验的评价  21-27
    1.5.1 核磁共振测试平台简介  21-23
    1.5.2 质谱测试平台简介  23-25
    1.5.3 ~(13)C标记实验的数据处理  25-27
  1.6 本实验研究的主要任务  27-28
第二章实验材料与方法  28-35
  2.1 实验材料  28-31
    2.1.1 实验仪器及设备  28-29
    2.1.2 实验药品及试剂的配制  29-31
  2.2 实验方法  31-35
    2.2.1 发酵液中有机酸和葡萄糖的检测方法  31-33
    2.2.2 GC-MS样品的制备及检测方法  33-35
第三章琥珀酸工程菌的厌氧优化发酵  35-40
  3.1 流加发酵  35-38
    3.1.1 流加发酵实验方法  35-36
    3.1.2 流加发酵实验结果  36-38
  3.2 TUQ2 批发酵  38-40
第四章大肠杆菌TUQ13 的~(13)C代谢通量分析  40-61
  4.1 发酵罐恒化条件的确定  40-49
    4.1.1 培养基组成的确定  40
    4.1.2 标记策略的种类划分  40-42
    4.1.3 大肠杆菌TUQ13 的恒化培养  42-49
  4.2 ~(13)C标记过程  49-50
  4.3 GC-MS样品的制备及测试样品的完成  50-55
    4.3.1 样品提取及衍生过程的优化  50-55
    4.3.2 GC-MS测试过程的优化  55
  4.4 计算并确定胞内代谢通量的分布  55-61
    4.4.1 计算过程的介绍  55-57
    4.4.2 结果与讨论  57-61
第五章结论与展望  61-63
参考文献  63-69
发表论文和参加科研情况说明  69-70
致谢  70-71
附录  71-78

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