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S-211枯草芽孢杆菌固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的研究

作　者: 宋敏
导　师: 王和平
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 枯草芽孢杆菌固态发酵羊胃容物木聚糖酶正交优化分离纯化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

以产胞外木聚糖酶的实验室保藏菌种枯草芽孢杆菌S-211为研究对象,分别从培养基组分、无机盐离子、接种量、发酵时间、发酵温度及初始pH等单因素出发,研究了这些因素对枯草芽孢杆菌S-211固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响,并对影响因素进行了正交优化。其研究结果表明:适宜于枯草芽孢杆菌S-211固态发酵的最佳培养基配方为:（在100mL三角瓶中加入10g培养基）羊胃容物:玉米粉:豆饼粉:麸皮=50:12:19:19、Mn²⁺0.6g/L、Na+ 7g/L、Mg²⁺5g/L、K⁺14g/L、Fe²⁺ 0.3g/L、Ca²⁺6g/L、Zn²⁺ 0.5g/L。发酵培养基配方确定后,通过对初始pH值、接种量、发酵温度、发酵时间等发酵条件的摸索,确定最佳发酵工艺条件为:初始pH 7.0、接种量4mL（即在每100mL三角瓶中接入4mL浓度为10⁷cfu/mL的孢子悬液）、发酵温度30℃、发酵时间36h,经优化后的枯草芽孢杆菌S-211固态发酵50%羊胃容物产木聚糖酶酶活达到了1219.63U/mL,较原始基础发酵培养基在常规培养条件下的酶活676.21U/mL提高了1.8倍,为放大枯草芽孢杆菌S-211固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的发酵工艺条件提供了可靠的理论依据。按优化后的条件对枯草芽孢杆菌S-211进行产酶培养,得到粗酶液。发酵液经20%-80%硫酸铵分级沉淀、透析袋浓缩、Sephadex-G25脱盐、Sephadex-G100凝胶层析分离纯化后,得到一个电泳纯的木聚糖酶,酶纯化倍数为5.28,回收率为30.98%,比活达14.58IU/mg。该酶经SDS-PAGE显示为单一电泳带,分子量为37.8KDa。对枯草芽孢杆菌S-211木聚糖酶进行酶学性质测定,结果表明该酶最适反应温度为55℃,在25℃-50℃具有较好的稳定性;最适反应pH值为pH6.0,在pH4.0-pH8.6具有较好的稳定性;Pb²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺对酶有抑制作用,Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、K⁺对酶有一定的激活作用;在55℃,pH6.0条件下,该酶对木聚糖的米氏常数Km为5.202mg?mL,最大反应速度Vmax为0.243mg/（min·mL）。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-12
1 引言  12-26
  1.1 枯草芽孢杆菌的生物学特点  13
  1.2 木聚糖简介  13-15
    1.2.1 木聚糖的概念  13
    1.2.2 木聚糖的来源  13
    1.2.3 木聚糖的结构  13-14
    1.2.4 木聚糖的性质  14-15
    1.2.5 木聚糖的降解  15
  1.3 木聚糖酶简介  15-25
    1.3.1 木聚糖酶的概念  15
    1.3.2 木聚糖酶的来源  15-16
    1.3.3 木聚糖酶的分子结构  16-17
    1.3.4 木聚糖酶性质  17-19
    1.3.5 木聚糖酶的检测方法  19
    1.3.6 木聚糖酶基因的克隆与表达  19-21
    1.3.7 木聚糖酶的应用  21-23
    1.3.8 木聚糖酶生产技术研究现状  23-24
    1.3.9 木聚糖酶的研究趋势和发展方向  24-25
  1.4 课题的主要研究目的，意义和研究内容  25-26
    1.4.1 研究目的  25
    1.4.2 研究意义  25-26
    1.4.3 研究内容  26
2 材料与方法  26-39
  2.1 实验材料  26-32
    2.1.1 实验菌株  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 主要仪器  27
    2.1.4 培养基  27
    2.1.5 试剂配制  27-32
  2.2 实验方法  32-39
    2.2.1 孢子悬液的制备  32
    2.2.2 木糖标准曲线的绘制  32
    2.2.3 粗酶液的制备  32-33
    2.2.4 酶活测定  33
    2.2.5 酶活力单位定义  33
    2.2.6 含 50%羊胃容物固态发酵培养基组分的正交优化  33-34
    2.2.7 发酵温度对产木聚糖酶的影响  34
    2.2.8 发酵时间对产木聚糖酶的影响  34
    2.2.9 接种量对产木聚糖酶的影响  34
    2.2.10 初始pH 对产木聚糖酶的影响  34
    2.2.11 相同浓度不同金属离子对产木聚糖酶的影响及有促进发酵作用的金属离子的优化  34
    2.2.12 促进发酵作用的金属离子的优化  34-35
    2.2.13 综合发酵条件的研究  35
    2.2.14 透析袋的处理  35
    2.2.15 菌株发酵液的制备  35
    2.2.16 木聚糖酶粗蛋白的提取  35
    2.2.17 酶液的透析脱盐和浓缩  35-36
    2.2.18 蛋白质浓度的测定  36-37
    2.2.19 葡聚糖凝胶层析  37
    2.2.20 SDS-PAGE 电泳  37-38
    2.2.21 Native-PAGE  38
    2.2.22 蛋白质样品的冷冻干燥  38
    2.2.23 木聚糖酶的最适反应温度  38-39
    2.2.24 木聚糖酶热稳定性的研究  39
    2.2.25 木聚糖酶的最适pH  39
    2.2.26 木聚糖酶pH 稳定性的研究  39
    2.2.27 金属离子对木聚糖酶活力的影响  39
    2.2.28 动力学常数Km 值的研究  39
3 结果与分析  39-55
  3.1 含 50%羊胃容物固态发酵培养基组分的确定  39-41
  3.2 发酵温度的确定  41-42
  3.3 发酵时间的确定  42
  3.4 接种量的确定  42-43
  3.5 初始pH 的确定  43
  3.6 有促进发酵作用的金属离子的确定  43-47
  3.7 综合发酵条件  47-48
  3.8 饱和硫酸铵分级沉淀最佳饱和度的确定  48-49
  3.9 葡萄糖凝胶层析  49-51
    3.9.1 Sephadex-G25 凝胶柱层析  49-50
    3.9.2 Sephadex-G100 凝胶柱层析  50-51
  3.10 Native-PAGE  51
  3.11 SDS-PAGE  51-52
  3.12 各步纯化的比活力和纯化倍数  52-53
  3.13 木聚糖酶的最适反应温度研究  53
  3.14 木聚糖酶热稳定性的研究  53-54
  3.15 木聚糖酶的最适pH 研究  54
  3.16 木聚糖酶pH 稳定性的研究  54
  3.17 金属离子对木聚糖酶活力影响的研究  54-55
  3.18 动力学常数Km 值的研究  55
4 结论  55-56
5 讨论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-65
附录  65-66
作者简介  66

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