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金属纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器

作　者: 黑婷婷
导　师: 张耀东
学　校: 陕西师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 乙酰胆碱酯酶金/银纳米粒子 DDAO荧光染料有机磷生物缀合物
分类号: TP212.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

有机磷具有高效的杀虫能力,已经成为当今广泛使用的农药之一,有机磷农药的残留所引起的食品安全问题长期以来一直是人们所关注的焦点。因此,建立快速、可靠、灵敏、简便和实用的有机磷检测的分析方法,对于环境保护和食品安全等具有重要现实意义。生物传感器的研究和应用是实现实时、定位、在线分析的重要途径,已成为当前分析化学研究领域热点之一。基于AChE的有机磷生物传感器的研究越来越受到人们的重视,其中包括光学、电学、电化学、热学、磁学等换能器。由于荧光法检测具有灵敏度高、良好的组织穿透力、高空间分辨率和成本低等优点,因此最受人们的亲睐而且得到广泛的应用。生物缀合物是指两个或两个以上具有生物活性的分子连接起来形成一个新的复杂的生物复合物,同时具有各个组成分子的性能。本论文的研究目的是：将贵金属纳米材料(即金和银纳米粒子)和乙酰胆碱酯酶(AChE)共价结合形成生物缀合物来构建分子纳米传感器,利用金属纳米子结合于AChE对荧光探针的影响,建立高灵敏度、快速响应的有机磷检测新方法。本论文分为三章,第一章为绪论,简要综述了蛋白质荧光生物传感器和贵金属纳米材料在生物传感分析中的研究进展；介绍了乙酰胆碱酯酶的特点和应用；归纳了贵金属纳米材料的基本性质、化学修饰以及在分析化学中的应用；并论述了本论文的研究思路、目的和意义。第二章和第三章为实验部分,具体内容如下：第二章金纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one) (DDAO)是一类红色的荧光染料分子。利用金属纳米粒子对DDAO荧光特性的影响,本章建立了基于乙酰胆碱酯酶的有机磷检测新方法,并初步探讨了分子传感机理。首先,利用巯基与Au形成共价键的作用,将11-巯基十一烷酸(MUA)共价结合到金纳米粒子上,再通过EDC/NHS将羧基活化,然后利用乙酰胆碱酯酶分子上的自由氨基,将AChE共价固定在金纳米粒子上,形成AuNPs/AChE缀合物：利用吸收光谱、透射电镜等方法对合成的金纳米粒子、AuNPs/AChE等缀合物进行了表征,考察了温度和pH值对缀合物的影响。研究了AuNPs/AChE生物缀合物对对氧磷的生物传感器性能；还测定了DDAO与AChE的双分子结合速率常数和抑制常数,探讨了DDAO对AChE的抑制类型、对氧磷与AuNPs-AChE-DDAO生物缀合物的结合常数等；利用Autodock4.2软件,对DDAO与乙酰胆碱酯酶的分子对接进行了研究。结果表明：吸收光谱图和透射电子显微镜图片表明了AuNPs/AChE缀合物的形成。与自由酶相比,在同样的温度和酸度条件下,固定化的AChE具有更好的稳定性。当AuNPs/AChE生物缀合物存在时,DDAO的荧光强度急剧增加,对氧磷加入到此体系中后,DDAO则发生荧光猝灭,据此,建立了一种简单灵敏的测定对氧磷的方法,检出限为4×10-7M。该传感器具有很好的稳定性,响应快、灵敏度高等优点。对DDAO与AChE的相互作用研究表明,DDAO对AChE有很强的抑制作用,抑制常数的大小为Ki为1.1×10-7M,属混合型抑制。对氧磷与AuNPs-AChE-DDAO生物缀合物的结合常数为3.2×106L·mol-1,说明对氧磷与DDAO/AChE/AuNPs具有强的相互作用；分子对接的结果表明,与对氧磷结合于AChE的活性中心Ser200不同,DDAO结合于AChE的外周阴离子位点,表明了DDAO-AChE-AuNPs对对氧磷的传感性是由于其对生物缀合物中AChE分子构象的扰动,引起DDAO周围微环境的改变,造成荧光发射性能的改变。第三章银纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器在第二章的研究中,发现了金纳米粒子对复合物中荧光探针DDAO具有增敏作用,尽管有文献报道金纳米粒子具有荧光增敏作用,但大量文献报道金纳米粒子具有荧光猝灭作用,这取决于金纳米粒子与荧光探针之间的距离,更多的文献报道银纳米粒子具有荧光增敏作用。为了进一步验证实验结果,本章将银纳米粒子标记于乙酰胆碱酯酶上进行研究。利用吸收光谱、透射电镜等方法对合成的银纳米粒子、AgNPs/AChE缀合物进行了表征,考察了温度和pH值对缀合物的影响。研究了AgNPs/AChE生物缀合物对对氧磷的生物传感器性能。我们还测定了对氧磷与AgNPs-AChE-DDAO生物缀合物的结合常数。结果表明：吸收光谱图和透射电子显微镜图片表明了AgNPs/AChE缀合物的形成。与自由酶相比,在同样的温度和酸度条件下,固定化的AChE同样具有更好的稳定性,对氧磷与AgNPs-AChE-DDAO生物缀合物的结合常数为1.7×106L·mol-1,说明对氧磷与DDAO/AChE/AgNPs也具有较强的相互作用。AgNPs/AChE生物缀合物的存在同样对DDAO具有荧光增敏作用,对氧磷加入到此体系中后,DDAO则同样发生荧光猝灭作用,说明DDAO/AChE/AgNPs生物缀合物同样可对对氧磷进行高灵敏的生物传感分析。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第1章绪论  10-30
  1.1 基于蛋白质荧光生物传感器  10-18
    1.1.1 蛋白质荧光生物传感器概述  10-13
    1.1.2 酶的结构与功能  13-14
    1.1.3 乙酰胆碱酯酶(AChE)的概述  14-18
  1.2 金属纳米材料的概述及其应用  18-29
    1.2.1 金属纳米材料的概述及其应用  18-19
    1.2.2 金/银纳米粒子的性质  19-23
    1.2.3 金/银纳米粒子的表面修饰方法及意义  23-24
    1.2.4 金/银纳米粒子在分析中的一些应用  24-29
  1.3 本论文的选题目的及意义  29-30
第2章金纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器  30-58
  2.1 引言  30-31
  2.2 本章基本思路  31
  2.3 实验部分  31-38
    2.3.1 试验试剂及仪器  31-32
    2.3.2 金纳米粒子的合成  32
    2.3.3 金纳米粒子生物缀合物(GNPs-MUA-AChE)的制备  32-33
    2.3.4 AuNPs/AChE共轭复合物传感性原理  33-34
    2.3.5 不同T和pH对酶活性的选择  34-35
    2.3.6 结合常数的测定  35-36
    2.3.7 双分子结合速率常数、抑制类型及抑制常数的测定  36-37
    2.3.8 乙酰胆碱酯酶与DDAO的分子对接  37-38
    2.3.9 对氧磷的检测  38
  2.4 实验结果与讨论  38-56
    2.4.1 金纳米粒子的表征  38-42
    2.4.2 不同试剂对DDAO荧光强度的影响  42-44
    2.4.3 不同温度和pH对AChE和AChE/AuNPs的酶相对活性影响  44-46
    2.4.4 结合常数的测定  46-47
    2.4.5 双分子结合速率常数和抑制剂(DDAO)对AChE的抑制类型的测定  47-52
    2.4.6 乙酰胆碱酯酶与DDAO的分子对接结合图  52-55
    2.4.7 功能化的金纳米粒子荧光法测定有机磷的分析特性  55-56
  2.5 本章小结  56-58
第3章银纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器  58-70
  3.1 引言  58-59
  3.2 本章基本思路  59
  3.3 实验部分  59-61
    3.3.1 试验试剂及仪器  59-60
    3.3.2 银纳米粒子的合成  60
    3.3.3 银纳米粒子生物缀合物的制备  60-61
    3.3.4 银纳米粒子的表征手段  61
    3.3.5 结合常数测定  61
  3.4 实验结果与讨论  61-69
    3.4.1 功能化的银纳米粒子表征  61-64
    3.4.2 AChE/AgNPs复合物对DDAO荧光强度的影响  64-65
    3.4.3 不同T和pH对AChE和AChE/AgNPs的酶相对活性影响  65-67
    3.4.4 结合常数的测定  67-68
    3.4.5 标准曲线的绘制  68-69
  3.5 本章小结  69-70
结论  70-72
参考文献  72-84
致谢  84-86
攻读学位期间研究成果  86

金属纳米粒子增强荧光有机磷生物传感器

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