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害虫捕食性天敌拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶毒理学特性研究

作　者: 邵颖
导　师: 刘泽文
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶杀虫剂选择性表达谱体外表达
分类号: S481.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)是一种丝氨酸水解酶,主要功能是在神经突触处通过快速水解神经递质—乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)而中止神经冲动传递,从而使神经活动的过程中断。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的主要作用靶标,杀虫剂与酶分子结合后可钝化酶的活性,使乙酰胆碱在突触处积累而使受体受到刺激,造成长期兴奋过度,阻断神经冲动的传导(去极化阻断),导致昆虫生理生化过程失调和破坏,最终造成昆虫死亡。拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata是农田蜘蛛中的重要优势种群之一,是稻田害虫的重要捕食性天敌,在害虫的生态调控和害虫生物防治中起着非常重要的作用。因此,杀虫剂对拟环纹豹蛛的毒性是害虫化学防治中必须考虑的问题之一,避免对包括拟环纹豹蛛在内的天敌生物高杀伤作用,是充分发挥天敌生物防治的基本原则之一。为了更好的了解农药对天敌蜘蛛与昆虫的选择性,以保护利用蜘蛛控制害虫,本文用分子生物学方法克隆了拟环纹豹蛛两个乙酰胆碱酯酶基因：AChE1和AChE2,通过与昆虫ace基因相比,探索了有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对蜘蛛与昆虫的选择性,并对两个乙酰胆碱酯酶基因在蜘蛛不同组织的表达量进行了测定;同时将两个基因转入昆虫细胞进行了表达研究,初步分析了拟环纹豹蛛两个乙酰胆碱酯酶的毒理学特性,为研究新型高效高选择性的杀虫剂提供理论依据。一、拟环纹豹蛛两种乙酰胆碱酯酶基因的克隆与分析采用简并引物PCR和RACE技术首次克隆了害虫主要捕食性天敌拟环纹豹蛛2个乙酰胆碱酯酶基因全长,其中第一个AChE基因推导的氨基酸序列含有昆虫乙酰胆碱酯酶两个保守区域"WIY(F)GGG"和"TLFGESAE";第二个AChE基因推导的氨基酸序列含有昆虫乙酰胆碱酯酶"WIY(F)GGG"。根据同源性比较和系统进化关系,分别将这两个基因命名为Pp-ace1和Pp-ace2。为了研究杀虫剂对拟环纹豹蛛和害虫的选择性的分子机制,搜集所有已报道的含有与抗性相关突变位点的昆虫乙酰胆碱酯酶序列,与拟环纹豹蛛的乙酰胆碱酯酶序列进行对比分析,发现在拟环纹豹蛛和昆虫AChE2在已报道的抗性突变位点上的存在氨基酸差异;在乙酰胆碱酯酶重要功能位点上,也发现拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶与昆虫乙酰胆碱酯酶存在一些重要氨基酸差异,这些差异是否会影响农药对蜘蛛与昆虫的选择性还需进一步研究。二、拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶不同组织的表达量利用实时荧光定量PCR技术分析了Pp-acel和Pp-ace2在不同组织中的转录水平。在测试的不同组织中,发现Pp-ace1的表达量要高于Pp-ace2,这与报道过的在昆虫中两种AChE基因表达量相一致。两种AChE在部均具有高表达量,相对于腹部的表达量,足部Pp-acel的表达量为9.8, Pp-ace2表达量为2.2,均高于其它组织表达量。同时,Pp-ace1在头胸部,消化道,和心脏也高表达,Pp-ace2在消化道具有较高表达量。Pp-ace1和Pp-ace2在毒腺和脂肪体中几乎没有表达。Pp-ace1和Pp-ace2在足部差异最大,Pp-ace1是Pp-ace2的4.5倍,在头胸部,消化道,腹部,心脏和卵巢中Pp-ace1/Pp-ace2的比值在1-2.33之间。三、两个乙酰胆碱酯酶在Bac-to-Bac系统中的表达利用Bac-to-Bac系统,成功地在昆虫sf9细胞中表达两个乙酰胆碱酯酶基因。昆虫细胞被感染第72小时,从Pp-ace1和Pp-ace2得到的结合蛋白活性达最高,此后至第96小时活性迅速下降,因此,我们一般在细胞感染后2-3天收取培养液,进行实验。对两个AChE表达产物活性进行检测,发现重组Pp-ace1的活性明显高于Pp-ace2。抑制实验表明,表达的Pp-ace1比Pp-ace2对杀虫剂更为敏感。两个表达产物对杀螟松的敏感性相当,但表达的Pp-ace1但对异丙威和仲丁威的敏感性比Pp-ace2分别高31倍和54倍。两种重组蛋白对仲丁威最为敏感,仲丁威对表达的Pp-ace1的抑制作用是杀螟松的188倍。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-12第一章文献综述 12-28 1 胆碱酯酶概述 12-13 2 乙酰胆碱酯酶的研究进展 13-24 2.1 乙酰胆碱酯酶结构 13-16 2.2 酰胆碱酯酶生理功能 16-17 2.3 酰胆碱酯酶的基因分析 17-19 2.4 昆虫乙酰胆碱酯酶研究进展 19-22 2.5 蛛形纲生物乙酰胆碱酯酶研究进展 22-24 3 农药对天敌的选择性 24-26 4 研究目的与意义 26-28第二章拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶基因的克隆与表达谱分析 28-52 1 材料与方法 28-35 1.1 供试生物 28 1.2 主要试剂 28-29 1.3 总RNA提取及cDNA模板合成 29-30 1.4 PCR引物设计 30-31 1.5 拟环纹豹蛛AChE基因的克隆 31-34 1.5.1 cDNA片断的PCR扩增 31-32 1.5.2 RACE扩增AChE全长基因 32 1.5.3 纯化、克隆与测序 32-34 1.5.4 序列分析 34 1.6 实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 34-35 1.6.1 引物设计 34-35 1.6.2 乙酰胆碱酯酶基因个组织表达量的比较 35 2 结果与分析 35-49 2.1 拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶基因的测序与分析 35-37 2.1.1 AChE1基因保守片段的克隆和分析 35-36 2.1.2 RACE扩增AChE1基因全长序列 36 2.1.3 AChE2基因保守片段的克隆和分析 36 2.1.4 RACE扩增AChE2基因全长序列 36-37 2.2 拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶扩增序列拼接结果及分析 37-45 2.2.1 AChE1扩增序列拼接结果及分析 37-39 2.2.2 AChE2扩增序列拼接结果及分析 39-41 2.2.3 两种乙酰胆碱酯酶基因与各种昆虫乙酰胆碱酯酶基因序列比对 41-42 2.2.4 两种乙酰胆碱酯酶系统发生树 42-43 2.2.5 拟环纹豹蛛与昆虫在重要位点的差异 43-45 2.3 定量结果 45-49 2.3.1 荧光定量PCR产物熔解曲线及扩增效率一致性分析 45-48 2.3.2 两种AChE基因在拟环纹豹蛛不同组织的表达量 48-49 3 讨论 49-52第三章拟环纹豹蛛ACHE基因在昆虫细胞中的表达及敏感性变化 52-62 1 材料与方法 52-57 1.1 试验用虫 52 1.2 主要试剂 52-53 1.3 实验方法 53-57 1.3.1 总RNA的提取和cDNA合成 53 1.3.2 PCR引物 53-54 1.3.3 酶切与连接 54 1.3.4 重组杆状病毒构建 54-55 1.3.5 昆虫Sf9细胞的转染及鉴定 55 1.3.6 酶液的制备 55 1.3.7 乙酰胆碱酯酶活力测定 55-56 1.3.8 乙酰胆碱酯酶动力学参数测定 56 1.3.9 蛋白量的测定 56-57 1.3.10 表达产物对杀虫剂敏感性测定 57 2 结果与分析 57-61 2.1 真核转移载体的构建 57-58 2.2 昆虫Sf9细胞的鉴定 58 2.3 细胞感染重组病毒后酶活性的时序变化 58-60 2.4 表达产物酶动力学测定 60 2.5 表达产物对杀虫剂敏感性测定 60-61 3 讨论 61-62全文总结 62-64参考文献 64-72附录:发表的学术论文 72-74致谢 74

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