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晚期糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞分泌NO的影响及其机制探讨

作　者: 张胜雷
导　师: 徐金升
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 晚期糖基化终末产物 人脐静脉内皮细胞 一氧化氮 超氧化物歧化酶 丙二醛 二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶
分类号: R692.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:以人脐静脉内皮细胞为实验对象,应用细胞培养、细胞免疫化学等方法观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)在不同浓度和不同作用时间下对血管内皮细胞损伤的作用。通过测定内皮细胞培养上清液中的一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)、NOS活性、MDA含量、SOD活性及内皮细胞DDAH2的表达情况,探讨AGE对人脐静脉内皮细胞NO分泌的影响及其机制。方法:取6-7代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为实验对象。实验分三组:AGEs组、HSA组,空白对照组(不加任何刺激因素)。AGE-HSA、HSA刺激终浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml,分别与人脐静脉内皮细胞共孵育24、48小时后留取细胞培养上清液,收集后在-20℃冰箱保存备用。采用MTT法检测AGE对内皮细胞增殖活性的影响,然后应用硝酸还原酶法、黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸反应法、NOS试剂盒分别检测各组上清液中NO浓度、SOD活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量、NOS活性,采用免疫细胞化学方法检测内皮细胞内DDAH2的表达情况。统计学方法采用SPSS13.0软件包进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组之间的比较采用独立样本t检验,P<0.05即认为有统计学意义。结果:1 AGEs-HSA对人脐静脉内皮细胞增殖活性的检测结果1.1 AGEs组中用25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/mlAGEs- HSA与内皮细胞共孵育24小时后测得的细胞生长抑制率分别为:9.32±4.99%、16.76±4.09%、40.29±9.86%、51.27±12.41%、58.88±9.08%、40.29±9.86%。其中100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml三组对细胞的生长抑制率均显著高于25ug/ml、50 ug/ml两组对细胞的生长抑制率, P <0.05,差异有统计学意义。1.2根据1.1所得结果将AGEs组分为低浓度(50ug/ml)、中浓度(100ug/ml)、高浓度(400ug/ml)三组分别与人脐静脉内皮细胞共同孵育24小时、48小时后测定其对内皮细胞的生长抑制率,低浓度组在24小时、48小时两个时间点的抑制率分别为19.52±4.09%、24.61±2.65%,P >0.05,差异无统计学意义;中浓度组在24小时、48小时两个时间点的抑制率分别为: 40.29±9.86%、60.91±3.73%,P <0.05,差异有统计学意义;高浓度组在24小时、48小时两个时间点的抑制率分别为:58.88±9.08%、75.28±2.00%,P <0.05,差异有统计学意义。2 AGEs-HSA对人脐静脉内皮细胞NO产生的影响2.1 AGEs组中用25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/mlAGEs-HSA与内皮细胞共孵育24小时后所测得细胞培养上清液中NO浓度分别为:81.70±4.08umol/l、65.36±9.27 umol/l、48.37±5.99 umol/l、39.87±2.99umol/l、24.18±8.16 umol/l。与HSA组相比,AGEs在浓度为100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml时能够明显抑制内皮细胞NO的产生,P <0.05,差异有统计学意义。2.2根据2.1所得结果将AGEs分为低浓度(50ug/ml)、中浓度(100ug/ml)、高浓度(400ug/ml)三组分别与人脐静脉内皮细胞共同孵育24小时、48小时后测定细胞培养上清液中NO的浓度,低浓度组在24小时、48小时两个时间点的NO浓度分别为:65.36±9.26 umol/l、32.68±2.99 umol/l,P <0.05,差异有统计学意义;中浓度组在24小时、48小时两个时间点的NO浓度分别为:48.37±5.99 umol/l、22.22±6.30umol/l,P <0.05,差异有统计学意义;高浓度组在24小时、48小时两个时间点的NO浓度分别为:24.18±8.16umol/l、7.840±3.92umol/l,P <0.05,差异有统计学意义。3 AGEs-HSA对人脐静脉内皮细胞NOS产生的影响3.1 AGEs组中用25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/mlAGEs-HSA与内皮细胞共孵育24小时后所测得细胞培养上清液中NOS的活性分别为:0.82±0.03u/ml、0.65±0.09 u/ml、0.48±0.05 u/ml、0.39±0.02 u/ml、0.24±0.08 u/ml。与HSA组相比,AGEs在浓度为100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml时能够明显抑制内皮细胞NOS的活性,P <0.05,差异有统计学意义。3.2根据3.1所得结果将AGEs分为低浓度(50ug/ml)、中浓度(100ug/ml)、高浓度(400ug/ml)三组分别与人脐静脉内皮细胞共同孵育24小时、48小时后测定细胞培养上清液中NOS的活性,低浓度组在24小时、48小时两个时间点的NOS活性分别为:0.65±0.09 u/ml、0.32±0.02 u/ml,P <0.05,差异有统计学意义;中浓度组在24小时、48小时两个时间点的NOS活性分别为:0.48±0.05 u/ml、0.22±0.06u/ml,P <0.05,差异有统计学意义;高浓度组在24小时、48小时两个时间点的NOS活性分别为:0.24±0.08u/ml、0.78±0.039u/ml,P <0.05,差异有统计学意义。4 AGEs-HSA对人脐静脉内皮细胞SOD活性的影响4.1 AGEs组中以不同浓度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的AGEs-HSA与内皮细胞共孵育24小时后所测SOD活性分别为:30.85±1.48活力单位/ml、28.06±0.53u/ml、22.94±0.97u/ml、17.36±1.83u/ml、10.25±3.52u/ml。与HSA组相比,AGEs在浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml时均能够明显抑制内皮细胞SOD的活性,P <0.05,差异有统计学意义。4.2根据4.1所得的结果将AGEs组分为低浓度(50ug/ml)、中浓度(100ug/ml)、高浓度(400ug/ml)三组分别与人脐静脉内皮细胞共同孵育24小时、48小时后测定细胞培养上清液中SOD的活性,低浓度组在24小时、48小时两个时间点的SOD的活性分别为:28.06±0.53 u/ml、24.02±1.55 u/ml,P <0.05,差异有统计学意义;中浓度组在24小时、48小时两个时间点的SOD活性分别为:22.94±0.97 u/ml、21.54±1.59 u/ml,P >0.05,差异无统计学意义;高浓度组在24小时、48小时两个时间点的SOD活性分别为:、10.25±3.52 u/ml、11.95±1. 36 u/ml,P >0.05,差异无统计学意义。5 AGEs-HSA对人脐静脉内皮细胞MDA含量的影响5.1 AGEs组中以不同浓度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的AGEs-HSA与内皮细胞共孵育24小时后所测MDA浓度分别为:1.59±0.13nmol/ml、1.82±0.17 nmol/ml、1.88±0.17nmol/ml、2.20±0.08nmol/ml、2.35±0.17nmol/ml。与HSA组相比,AGEs在浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml时均能够明显增加内皮细胞MDA的含量,P <0.05,差异有统计学意义。5.2根据5.1所得的结果将AGEs组分为低浓度(50ug/ml)、中浓度(100ug/ml)、高浓度(400ug/ml)三组分别与人脐静脉内皮细胞共同孵育24小时、48小时后测定细胞培养上清液中MDA的含量,低浓度组在24小时、48小时两个时间点的MDA的含量分别为:1.82±0.17 nmol/ml、1.84±0.17 nmol/ml,P >0.05,差异无统计学意义。中浓度组在24小时、48小时两个时间点的MDA的含量分别为:1.88±0.17 nmol/ml、1.90±0.17 nmol/l,P >0.05,差异无统计学意义。高浓度组在24小时、48小时两个时间点的MDA的含量分别为:2.35±0.17nmol/ml、1.64±0.13 nmol/ml,P >0.05,差异无统计学意义。6 AGEs对人脐静脉内皮细胞DDAH2含量的影响6.1用100ug/ml的AGEs-HSA刺激内皮细胞共孵育24、48小时后所测DDAH2的含量分别为:18282.29±1301.31、4466.02±2897.11。P <0.05,差异有统计学意义。6.2用100ug/ml的AGEs-HSA和AGES-HSA+RAGE刺激内皮细胞共孵育24小时后所测DDAH2的含量分别为: 18282.29±1301.31、5610.41±334.46。P <0.05,差异有统计学意义。结论:1 AGEs可抑制体外培养的人脐静脉内皮细胞的增殖活性,并呈一定的浓度和时间依赖性。2 AGEs对体外培养的人脐静脉内皮细胞NO的分泌具有抑制作用。是通过增加MDA的含量和降低SOD的活性而使人脐静脉内皮细胞处于氧化应激状态进而使内皮细胞胞浆内NOS的活性降低来实现的。3 AGEs使人脐静脉内皮细胞DDAH2活性的降低,可能是增加了细胞内ADMA的含量,进而使NOS的底物相对减少,而导致人脐静脉内皮细胞分泌NO降低。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
前言  12-13
材料与方法  13-21
结果  21-25
附图  25-32
附表  32-39
讨论  39-42
结论  42
参考文献  42-44
综述  44-54
  参考文献  50-54
致谢  54-55
个人简历  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学（泌尿生殖系疾病） > 肾疾病 > 肾功能衰竭
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