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活化的小胶质细胞对血视网膜屏障的影响

作　者: 廖宇洁
导　师: 徐格致
学　校: 复旦大学
专　业: 眼科学
关键词: 小胶质细胞 培养 鉴定 脂多糖 肿瘤坏死因子-α 人脐静脉内皮细胞 血管内皮生长因子 紧密连接 血视网膜屏障 伊文思兰
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：1探讨高效的大鼠视网膜小胶质细胞培养分离纯化的方法,并观察脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活的小胶质细胞形态和功能变化。2研究活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞紧密连接蛋白Z0-1和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。3观察活化的小胶质细胞玻璃体腔注射对大鼠血视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的影响。方法：1原代培养大鼠视网膜胶质细胞,用振摇法分离纯化小胶质细胞并鉴定；用不同浓度的LPS激活小胶质细胞24 h,观察不同浓度的LPS对小胶质细胞增殖的影响,并检测小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的变化。2视网膜小胶质细胞纯化后分为3组：A,空白对照组；B,未激活的小胶质细胞组；C,100 ng/mL LPS激活的小胶质细胞组；然后采用Transwell小室与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)共培养24 h。用细胞免疫荧光染色观察各组HUVECs紧密连接蛋白ZO-1的表达,并用Western Blot方法检测各组细胞VEGF和ZO-1的表达。3将大鼠随机分为A组、B组和C组。A组,玻璃体腔注射不含小胶质细胞的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS); B组,玻璃体腔注射含有未激活小胶质细胞的PBS；C组,玻璃体腔注射含有100 ng/mLLPS激活的小胶质细胞的PBS。7d后用Western Blot方法检测小胶质细胞玻璃体腔注射后各组大鼠视网膜Z0-1和VEGF的表达,并观察伊文思兰(evans blue, EB)渗透量的变化。结果：1分离纯化的小胶质细胞折光性强,纯度97.6%；LPS活化的小胶质细胞形态发生改变,特异性标记抗体CDllb表达上调；浓度100 ng/mL及以下的LPS活化小胶质细胞24 h不影响小胶质细胞数量(P＞0.05),浓度为1000 ng/mL的LPS作用24 h可使小胶质细胞数量减少(P＜O.05)；浓度低于1 ng/mL的LPS不能诱导视网膜小胶质细胞释放TNF-α(P>0.05);浓度1 ng/mL及以上的LPS均可诱导小胶质细胞产生TNF-α(P<0.05),并呈剂量递增趋势。2体外实验细胞免疫荧光染色结果显示,100 ng/mL LPS活化的小胶质细胞与HUVECs共培养24 h后,HUVECs的Z0-1表达低于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组。Western Blot结果亦显示,三组细胞的Z0-1和VEGF蛋白表达不全相同,差异有统计学意义(P＜0.05,分别F=21.2,F=9.28)；C组Z0-1的表达低于B组和A组(P＜0.05,分别F=0.07,F=0.12),而VEGF表达则高于B组和A组(P＜0.05,分别F=0.06,F=0.08)。3体内实验Western Blot结果显示,三组动物视网膜的ZO-1和VEGF蛋白表达不全相同,差异有统计学意义(P＜0.05,分别F=5.70,F=4.63)；玻璃体腔注射活化的小胶质细胞组Z0-1的表达低于空白对照组(P＜0.05,F=0.15),而VEGF表达则高于空白对照组(P＜0.05,F=0.13)。视网膜EB渗透实验结果显示,三组动物视网膜EB渗透量不全相同,差异有统计学意义(P＜0.05,F=19.21),C组分别与A组和B组比较,EB渗透量不同,差异有统计学意义(P＜0.05,分别F=62.06,F=33.41),C组的EB渗透量大于A组和B组。结论：1本实验方法培养的小胶质细胞纯度高,并建立了活化模型,为小胶质细胞的生理和病理研究奠定了基础。2活化的小胶质细胞影响血管内皮细胞表达VEGF和ZO-1,可能是导致屏障功能破坏的重要机制之一3活化的小胶质细胞可破坏血视网膜屏障,使血管通透性增加。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
第一部分  11-28
  1 目的  11
  2 材料  11-12
  3 方法  12-16
  4 结果  16-26
  5 讨论  26-27
  6 小结  27-28
第二部分  28-38
  1 目的  28
  2 材料  28-29
  3 方法  29-34
  4 结果  34-36
  5 讨论  36-37
  6 小结  37-38
第三部分  38-44
  1 目的  38
  2 材料  38-39
  3 方法  39-40
  4 结果  40-42
  5 讨论  42-43
  6 小结  43-44
全文总结与展望  44-46
参考文献  46-50
综述  50-56
  参考文献  53-56
致谢  56-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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