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一种基于细胞内转录的猪瘟病毒快速拯救系统

作　者: 黄俊华
导　师: 仇华吉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒反向遗传操作逆转录病毒 T7 RNA聚合酶稳定细胞系
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疫病名录(OIE-listed diseases)。为建立一种不依赖辅助病毒的高效拯救系统,用于CSFV的反向遗传操作,本研究利用逆转录病毒介导建立稳定表达T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的PK-15细胞系,在构建CSFV石门株全长感染性cDNA克隆的基础上,利用体外转录拯救系统和细胞内转录的拯救策略均成功拯救出子代病毒,这种基于细胞内转录的拯救系统比体外转录拯救病毒的操作更简便、效率更高。采用PCR方法,以大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7,用脂质体转染至PT67细胞,获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞,通过G418加压筛选和单细胞克隆纯化,并采用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RFP)瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,建立了稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7。经验证,该细胞系在压力培养条件下连续传至20代均能保持T7 RNAP的转录活性。以适应PK-15细胞的CSFV石门株为遗传材料,通过RT-PCR扩增得到了覆盖其基因组全长的6个cDNA片段,顺次插入到pOK12载体中,构建了CSFV石门株基因组cDNA克隆pOKShimen,经SrfI线性化,体外转录所得的RNA转染PK-15细胞,获得病毒vShimen;同时在pOKShimen 3′端引入丁型肝炎病毒核酶(Rz)和T7终止子(TΦ),获得阳性质粒pOKShimen-RzTΦ,直接转染PK/T7细胞获得子代病毒vShimen-RzTΦ。分别采用RT-PCR、荧光定量PCR、IFA、ELISA和电镜观察对上述两种方法拯救的病毒进行验证,结果表明,vShimen-RzTΦ与vShimen是基本一致的,且存在分子标签;病毒动力学生长曲线的结果表明,vShimen-RzTΦ表现出与vShimen与和亲本病毒wtShimen相似的生物学特性,vShimen-RzTΦ的最高滴度与vShimen没有显著差异;另外通过对子代病毒基因组进行测序证明vShimen-RzTΦ在PK/T7细胞上具有较好的遗传稳定性。细胞内转录拯救系统具有效率高、周期短、成本低和稳定性好的优点,能应用于猪瘟病毒的快速高效拯救。本研究建立了稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,并在此基础上实现了对石门株感染性克隆子代病毒的快速高效拯救,结果表明建立的以cDNA为基础的细胞内转录的病毒拯救系统大大提高了CSFV反向遗传操作的效率,为进一步揭示病毒致病机理和新型疫苗研制提供成熟的操作平台。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
英文缩略表  11-12
第一章绪论  12-19
  1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述  12-13
    1.1.1 猪瘟  12
    1.1.2 猪瘟病毒及其基因组结构  12-13
  1.2 猪瘟病毒的细胞培养  13
  1.3 逆转录病毒表达载体及其应用  13-14
  1.4 反向遗传操作概述  14-16
    1.4.1 病毒基因组全长cDNA 克隆的构建  14
    1.4.2 应用于反向遗传学的转录系统  14-15
    1.4.3 应用于反向遗传学的拯救系统  15-16
  1.5 猪瘟病毒感染性克隆的构建及病毒拯救的研究概况  16-18
  1.6 研究背景与目的  18-19
第二章稳定表达 T7 RNA 聚合酶 PK-15 细胞系的建立  19-27
  2.1 材料与方法  19-21
    2.1.1 菌株、质粒与细胞  19
    2.1.2 主要试剂  19
    2.1.3 T7 RNAP 基因的扩增与克隆  19
    2.1.4 表达 T7 RNAP 的重组逆转录病毒载体的构建  19-20
    2.1.5 瞬时表达红色荧光蛋白的重组质粒的构建  20
    2.1.6 筛选浓度的确定  20
    2.1.7 表达 T7 RNAP 的重组逆转录病毒的包装  20
    2.1.8 细胞系筛选  20-21
    2.1.9 PK/T7 细胞系T7 RNAP 基因的PCR 鉴定  21
    2.1.10 IFA 检测T7 RNAP 在PK/T7 细胞系中的表达  21
    2.1.11 PK/T7 细胞系T7 RNAP 转录活性的鉴定  21
    2.1.12 细胞系稳定性检测  21
  2.2 结果  21-25
    2.2.1 T7 RNAP 基因的扩增及克隆结果  21-22
    2.2.2 表达 T7 RNAP 的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定  22
    2.2.3 最佳筛选浓度的确定及细胞系筛选  22-23
    2.2.4 PK/T7 细胞系的PCR 鉴定结果  23
    2.2.5 IFA 检测T7 RNAP 在PK/T7 细胞系中的表达  23-24
    2.2.6 细胞系转录活性的鉴定结果  24
    2.2.7 细胞系稳定性检测的结果  24-25
  2.3 讨论  25-27
第三章猪瘟病毒的拯救及鉴定  27-45
  3.1 材料与方法  27-35
    3.1.1 菌株、质粒与细胞  27
    3.1.2 主要试剂  27
    3.1.3 引物设计  27-28
    3.1.4 CSFV 石门株基因组cDNA 克隆的构建及鉴定  28-30
    3.1.5 体外转录系统拯救病毒  30
    3.1.6 基于细胞内转录的病毒拯救  30-32
    3.1.7 RT-PCR 检测子代病毒  32
    3.1.8 荧光定量 RT-PCR 检测子代病毒  32-33
    3.1.9 IFA 检测子代病毒  33
    3.1.10 抗原 ELISA 检测子代病毒  33
    3.1.11 遗传标记的鉴定  33-34
    3.1.12 电镜观察  34
    3.1.13 病毒动力学生长曲线  34
    3.1.14 测序验证  34-35
  3.2 结果  35-42
    3.2.1 猪瘟病毒基因组cDNA 克隆各片段的扩增  35
    3.2.2 全长基因组cDNA 克隆的构建及鉴定  35-36
    3.2.3 子代病毒 RT-PCR 检测结果  36
    3.2.4 荧光定量 RT-PCR 检测结果  36-37
    3.2.5 IFA 检测结果  37-38
    3.2.6 抗原 ELISA 检测结果  38-39
    3.2.7 遗传标记鉴定结果  39-40
    3.2.8 电镜观察结果  40
    3.2.9 病毒动力学生长曲线  40-41
    3.2.10 测序验证结果  41-42
  3.3 讨论  42-45
第四章结论  45-46
参考文献  46-51
致谢  51-52
作者简历  52

一种基于细胞内转录的猪瘟病毒快速拯救系统

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