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稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的建立及鉴定

作　者: 宫君原
导　师: 周天鸿
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: 人巨细胞病毒 逆转录病毒 脂质体转染 pUL23 pUL49
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：pUL23和pUL49分别是人巨细胞病毒(human cytomegalo virus HCMV) UL23、UL49基因编码的蛋白。UL23是病毒生长的非必须基因,其表达产物pUL23是病毒皮层蛋白。UL49是病毒的必须基因,其表达产物pUL49也是是病毒皮层蛋白,两种病毒蛋白的功能还不清楚。通常病毒感染宿主细胞之后,其自身编码的蛋白通过与宿主蛋白或病毒蛋白自身蛋白相互作用,影响病毒生长、繁殖及致病过程。因此,大部分病毒蛋白发挥功能的场所是宿主细胞。建立稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系,将为研究pUL23和pUL49与宿主细胞蛋白的相互作用,及其在病毒生活周期中的作用提供有利工具。人包皮成纤维细胞(human primary foreskin fibroblasts HFF)和人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts HELF)是能够在体外感染HCMV的宿主细胞,原代的细胞病毒感染较好,因此,一般采用原代培养细胞作为HCMV的感染模型。本课题对在原代培养的哺乳动物细胞中建立稳定表达外源蛋白细胞系的方法进行了深入探讨。方法：1.稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的建立方法1)逆转录病毒感染法①构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-N 1-UL49-MYC;②包装含有pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-Nl-UL49-MYC、pLEGFP-N1的逆转录病毒,并感染HFF、HELF细胞；③分别用100ug/ml、700ug/ml浓度的G418筛选稳定表达pLEGFP-N1-UL23-FLAG. pLEGFP-N1-UL49-MYC、pLEGFP-N1的HFF、HELF细胞。2)脂质体转染法①建真核表达载体pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG;②质体转染pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)进入HELA细胞；③用1200ug/ml浓度的G418筛选稳定表达pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)的HELA细胞。2..稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的鉴定1)RT-PCR鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达提取稳定细胞系的RNA,做RT-PCR鉴定,电泳观察结果；2) Western-blotting鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达提取稳定细胞系的蛋白质,用特异性抗体检测；3)免疫荧光技术胞内鉴定病毒蛋白pUL23、pUL49的表达在稳定细胞系胞内,用特异性的抗体能够检测pUL23、pUL49的表达。3.病毒在HFF稳定细胞系中生长动力学的检测1) Towne病毒株能否感染稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系的检测；2) Towne病毒株在稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系中的多步生长曲线。结果：1)经双酶切、PCR以及测序鉴定证明逆转录病毒载体pLEGFP-N 1-UL23-FL AG、pLEGFP-N1-UL49-MYC和真核表达载体pCDNA3.1(+)-UL23-FLAG构建成功；2)通过观察逆转录病毒载体pLEGFP-N1包装出的逆转录病毒,感染HFF、HELF细胞后可见的绿色荧光,表明逆转录病毒包装成功；3)通过RT-PCR检测发现稳定细胞系能够在RNA水平上表达目的基因；4) Western-blotting检测发现稳定细胞系能够在蛋白水平上表达目的基因；5)免疫荧光技术检测发现稳定细胞系胞内能够表达pUL23、pUL49,且pUL23的胞内定位于文献报道相符合。6)HFF稳定细胞系中Towne的生长动力学与原代HFF细胞没有明显差异。结论：本文采用逆转录病毒感染的方法克服HFF、HELF原代培养细胞转染难的状况,成功地构建了稳定表达pUL23和pUL49的HFF、HELF细胞系；在RNA水平和蛋白质水平都检测到pUL23和pUL49的表达,并在稳定细胞系观察到pUL23定位在细胞质,pUL49主要定位在细胞核,pUL23与文献报道的定位一致,HFF稳定细胞系中Towne的感染和复制水平与原代HFF细胞没有明显差异。因此,本研究中获得的稳定表达pUL23和pUL49 HFF和HELF细胞系可以作为研究病毒蛋白pUL23和pUL49的工具。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-23
  1 研究背景  10-21
    1.1 人巨细胞病毒  10-12
    1.2 pUL23  12-14
    1.3 pUL49  14-16
    1.4 构建稳定细胞系的方法  16-21
  2 研究的目的及意义  21-23
    2.1 目的  21-22
    2.2 意义  22-23
实验材料与仪器  23-30
  1 仪器  23-24
  2 质粒、菌株、细胞株  24-25
  3 主要试剂  25-27
  4 主要试剂配方  27-30
实验方法  30-53
  1 逆转录病毒感染法构建稳定细胞系  30-44
    1.1 构建逆转录病毒载体  30-40
    1.2 AmphoPack~(TM)-293的培养  40-41
    1.3 逆转录病毒的包装、收集以及滴度的测定  41-42
    1.4 HFF、HELF细胞的培养  42-43
    1.5 HFF、HELF细胞G418工作浓度的筛选  43
    1.6 逆转录病毒的感染  43-44
    1.7 稳定细胞系的筛选及扩增、保存  44
  2 脂质体转染方法构建稳定细胞系  44-49
    2.1 构建真核表达载体  44-47
    2.2 HELA细胞的培养  47-48
    2.3 HELA细胞G418工作浓度的筛选  48
    2.4 HELA细胞的转染  48
    2.5 稳定细胞系的筛选及扩增、保存  48-49
  3 稳定表达HCMV pUL23和pUL49哺乳动物细胞系的鉴定  49-52
    3.1 稳定表达pUL23、pUL49哺乳动物细胞系的RT-PCR鉴定稳定  49-50
    3.2 稳定表达pUL23、pUL49哺乳动物细胞系的Western-blotting鉴定  50-51
    3.3 稳定表达pUL23、pUL49哺乳动物细胞系的免疫荧光鉴定  51-52
  4 Towne病毒株在稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系中生长动力学检测  52-53
    4.1 Towne病毒株能否感染稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系的检测  52
    4.2 Towne病毒株在稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系中的多步生长曲线  52-53
第一章 稳定表达pUL23的哺乳动物细胞系的建立及鉴定  53-68
  一 结果与分析  53-66
    1 逆转录病毒介导的稳定表达HCMV pUL23 HFF、HELF细胞系建立及鉴定  53-62
      1.1 构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-UL23-FLAG  53-55
      1.2 AmphoPack~(TM)-293的培养  55
      1.3 AmphoPack~(TM)-293转染  55-56
      1.4 HFF、HELF细胞的培养  56
      1.5 HFF、HELF细胞G418工作浓度的确定  56-57
      1.6 HFF、HELF细胞的感染  57-58
      1.7 HFF、HELF稳定细胞系的筛选和扩增  58-59
      1.8 稳定表达HCMV pUL23的HFF、HELF细胞系的RT-PCR鉴定  59-60
      1.9 稳定表达HCMV pUL23的HFF、HELF细胞系的western-blotting鉴定  60-61
      1.10 稳定表达HCMV pUL23的HFF、HELF细胞系的免疫荧光鉴定  61-62
    2 脂质体转染方法介导的稳定表达HCMV pUL23 HELA细胞系构建及鉴定  62-66
      2.1 构建真核表达载体  62-64
      2.2 HELA细胞的培养  64
      2.3 HELA细胞G418工作浓度的确定  64-65
      2.4 稳定表达HCMV pUL23的HELA细胞系的RT-PCR鉴定  65
      2.5 稳定表达HCMV pUL23的HELA细胞系的Western-blotting鉴定  65-66
      2.6 稳定表达HCMV pUL23的HELA细胞系的免疫荧光鉴定  66
  二 讨论  66-67
  三 小结  67-68
第二章 稳定表达pUL49的哺乳动物细胞系的建立及鉴定  68-75
  一 结果与分析  68-73
    1 逆转录病毒介导的稳定表达HCMV pUL49 HFF、HELF细胞系建立及鉴定  68-73
      1.1 构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-UL49-MYC  68-70
      1.2 AmphoPack~(TM)-293转染  70
      1.3 HFF、HELF细胞的感染  70
      1.4 HFF、HELF稳定细胞系的筛选和扩增  70
      1.5 稳定表达HCMV pUL49的HFF、HELF细胞系的RT-PCR鉴定  70-71
      1.6 稳定表达HCMV pUL49的HFF、HELF细胞系的western-blotting鉴定  71-72
      1.7 稳定表达HCMV pUL49的HFF、HELF细胞系的免疫荧光鉴定  72-73
  二 讨论  73-74
  三 小结  74-75
第三章 Towne在稳定表达pUL23和pUL49的HFF细胞中的生长动力学检测  75-78
  一 结果与分析  75-77
    1 Towne病毒株能否感染稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系的检测  75-76
    2 Towne病毒株在稳定表达pUL23、pUL49 HFF细胞系中的多步生长曲线  76-77
  二 讨论  77
  三 小结  77-78
全文讨论  78-81
  1 关于构建稳定细胞系方法的选择  78
  2 逆转录病毒的包装和感染  78-79
  3 G418筛选阳性克隆  79-81
参考文献  81-88
附录  88-95
致谢  95

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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