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实验背景：新生血管的生成是肿瘤生长和转移的关键环节之一,阻断或抑制新生血管的生成是治疗肿瘤的有效策略。近年来人们对血管的生成机制进行了广泛深入的研究,已证明血管的生成受多种相关因子的调节,相继发现了多种血管生成因子和抑制因子。以血管生成为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤治疗研究的热点,有多种血管生成抑制剂相继进入临床试验阶段。人纤溶酶原Kringle5(简称K5)是新近发现的一种血管生成抑制因子。它能作用于增生的血管内皮细胞,抑制细胞的增殖、迁移,并能诱导细胞凋亡,是最强的内源性血管增生抑制剂之一。由于K5区抑制内皮细胞增殖和抗迁移能力都较强,这使得K5的应用价值更为突出。目前,K5主要是通过基因工程重组技术获得,表达量低,纯化复杂,成本高,成为工业生产的瓶颈。实验目的：本实验目的在于获得表达量大、纯化高,而且有活性K5蛋白,为以后的抗肿瘤药物开发奠定基础。实验方法：分别用不同的感受态细胞BL-21、DH-5α、Top10,不同的诱导条件诱导表达K5/pGEX-5X-1,观察表达结果,优化表达条件,分析蛋白的可溶性,将获得的表达产物经过超声破碎菌体、洗涤、溶解、复性等纯化步骤纯化,摸索出最佳条件,过带GST标签的谷胱甘肽琼脂糖4B亲和柱纯化目的蛋白,获得高纯度的K5融合蛋白,鉴定产物,分析纯度、测定浓度。用凝血酶去除GST标签,再次纯化后用血管内皮细胞ECV304和裸鼠皮下移植瘤,分析其生物学活性、检测其体外抗肿瘤的作用。实验结果：1、筛选出了高效表达株,摸索出了较高表达量的条件：感受态细胞：BL21、诱导浓度：1mmol/L;诱导时间：6小时；诱导温度：37度；PH值：7.3。2、采用“裂解液超声破碎”的方法破碎菌体,分别用含2mol尿素、4mol尿素、6mol尿素的包涵体洗涤液洗涤、8mol尿素溶解包涵体,稀释复性后用带GST标签的谷胱甘肽琼脂糖4B亲和柱,纯化后纯度高。浓度为727μg/ml。3、凝血酶切掉标签后,纯化目的蛋白,用ECV304细胞测其体外活性,结果显示能有效抑制其生长。浓度为5μ/ml时抑制率最高。4、构建裸鼠皮下移植瘤模型,测定其对裸鼠肿瘤的抑制作用,结果显示加药组可抑制肿瘤生长。结论：本实验筛选得到了高效表达菌株,通过反复实验获得了较佳表达条件,提高了目标蛋白的表达量,利用GST载体纯化方便的优势,通过溶解、洗涤、溶解、复性、过亲和柱等步骤纯化后,获得了纯度较高的目的蛋白,用凝血酶切掉了标签,分别用血管内皮细胞ECV304和裸鼠皮下移植瘤模型初步测定其体外抗肿瘤的活性,结果证明目的蛋白能抑制血管内皮细胞的生长并抑制肿瘤增生,为以后的药物开发奠定基础。
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