学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

一种（+）γ-内酰胺酶的表达纯化与酶学性质的初步研究

作　者: 王佳宜
导　师: 郑国钧
学　校: 北京化工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: Microbacterium hydrocarbonoxydans (+)γ-内酰胺酶表达蛋白纯化
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 39次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

γ-内酰胺酶是一种新型的酰胺酶,能够催化酰胺类化合物的酰胺键水解。(+)γ-内酰胺酶能够高效拆分外消旋体γ-内酰胺,获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物阿巴卡韦((-)abacavir)的重要中间原料,具有巨大的经济价值。与化学合成法相比,生物催化具有的反应条件温和,特异性高,低能耗,底物专一性,重复使用,催化效率高等优点,已代替某些化学合成法投入应用。微生物酶法拆分外消旋体γ-内酰胺具有良好的应用前景。本课题从产γ-内酰胺酶菌株Microbac terium hydrocarbonoxydansL29-9-B-4中克隆出一段507bp的基因片段,连接至表达载体PET-30a(+)上,于大肠杆菌中获得高水平表达的重组(+)γ-内酰胺酶,酶蛋白的N端和C端分别引入了一段组氨酸序列,通过Ni亲和层析分离纯化重组(+)γ-内酰胺酶。最优条件下酶活可达20.6U/mg,(-)γ-内酰胺收率为45%,e.e.值可达99%。蛋白单体分子量约为18KDa,由铁氧还蛋白和γ-内酰胺酶两个结构域组成。最适温度和最适pH分别是30℃和6.5,50℃时10min即可失去全部活力。米氏常数为4.41mmol·L-1,最大反应速率为0.137mol·L-1·min。Fe2+(2mmol·L-1)与DTT(<10mmol·L-1)对酶活有明显的促进作用,酶蛋白被PMSF强烈抑制,金属螯合剂与电子传递系统中的一些重要因子(如NAD, NADH, NADPH,FAD,FMN)对酶活无明显影响。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章绪论  11-23
  1.1 手性及手性药物  11-12
    1.1.1 手性及手性药物的定义  11-12
    1.1.2 手性药物的作用机理  12
  1.2 手性药物的合成方法  12-14
    1.2.1 化学合成法  12-13
    1.2.2 生物合成法  13
    1.2.3 生物合成法的特点  13-14
  1.3 生物手性化技术的应用与展望  14-15
  1.4 (-)γ-内酰胺及其应用  15-18
    1.4.1 阿巴卡韦简介  16
    1.4.2 阿巴卡韦中间体的合成  16-18
    1.4.3 (±)γ-内酰胺的拆分  18
  1.5 基因的克隆与表达  18-19
    1.5.1 基因克隆策略  18-19
    1.5.2 重组蛋白的表达  19
  1.6 蛋白分离纯化  19-22
    1.6.1 离子交换层析  19-21
    1.6.2 凝胶过滤层析  21
    1.6.3 金属螯合层析  21-22
  1.7 课题研究的意义及研究内容  22-23
第二章 (+)γ-内酰胺酶的表达纯化  23-37
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料与仪器设备  23-25
    2.2.1 主要试剂及药品  23-24
    2.2.2 主要仪器  24-25
    2.2.3 菌株与质粒  25
    2.2.4 培养基  25
  2.3 实验方法  25-31
    2.3.1 γ-内酰胺酶基因的克隆  25-26
    2.3.2 引物  26
    2.3.3 模版  26
    2.3.4 PCR反应体系  26
    2.3.5 重组(+)γ-内酰胺酶基因的表达  26-29
    2.3.5 重组(+)γ-内酰胺酶分离纯化  29-30
    2.3.7 酶活检测  30-31
  2.4 结果与讨论  31-35
    2.4.1 γ-内酰胺酶基因的克隆  31-32
    2.4.2 重组(+)γ-内酰胺酶的表达与纯化  32-35
    2.4.3 酶活检测  35
  2.5 本章小结  35-37
第三章重组(+)γ-内酰胺酶酶学性质的研究  37-53
  3.1 引言  37
  3.2 实验材料与仪器设备  37-39
    3.2.1 主要试剂及药品  37-38
    3.2.2 主要仪器  38
    3.2.3 相关溶剂配制  38-39
  3.3 实验方法  39-42
    3.3.1 重组(+)γ-内酰胺酶酶活的定义  39
    3.3.2 BCA法测定蛋白浓度  39-40
    3.3.3 酶对底物的选择性水解  40
    3.3.4 酶的最适温度测定与耐热性研究  40
    3.3.5 酶的最适pH测定与pH耐受研究  40
    3.3.6 金属离子对酶活力的影响  40-41
    3.3.7 金属螯合剂、蛋白保护剂对酶活力的影响  41
    3.3.8 酶的米氏常数Km及Vmax的测定  41-42
  3.4 结果与讨论  42-51
    3.4.1 BCA法测定蛋白浓度  42-43
    3.4.2 酶对底物的选择性水解  43-44
    3.4.3 酶的最适温度测定与耐热性研究  44-46
    3.4.4 酶的最适PH测定与PH耐受研究  46-48
    3.4.5 金属离子对酶活力的影响  48-49
    3.4.6 金属螯合剂、蛋白保护剂对酶活力的影响  49-50
    3.4.7 酶的米氏常数Km及Vmax的测定  50-51
  3.5 本章小结  51-53
第四章重组(+)γ-内酰胺酶结构信息的初步研究  53-59
  4.1 引言  53
  4.2 实验材料与仪器设备  53-54
    4.2.1 主要试剂及药品  53-54
    4.2.2 主要仪器  54
  4.3 实验方法  54-55
    4.3.1 重组(+)γ-内酰胺酶序列比对  54
    4.3.2 氧气对酶活力的影响  54-55
    4.3.3 电子传递辅因子对酶活力的影响  55
    4.3.4 铁氧还蛋白结构对酶活的影响  55
  4.4 结果与讨论  55-57
    4.4.1 重组(+)γ-内酰胺酶序列比对  55-56
    4.4.2 氧气对酶活力的影响  56
    4.4.3 电子传递辅因子对酶活力的影响  56-57
    4.4.4 铁氧还蛋白结构对酶活的影响  57
  4.5 本章小结  57-59
第五章结论  59-61
参考文献  61-65
附录  65-67
致谢  67-69
研究成果及发表的学术论文  69-71
作者简介  71-72
北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书  72-73

一种（+）γ-内酰胺酶的表达纯化与酶学性质的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文