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1，3-丙二醇氧化还原酶酶促动力学研究

作　者: 刘海平
导　师: 郝健
学　校: 燕山大学
专　业: 应用化学
关键词: 1,3-丙二醇 3-羟基丙醛 1,3-丙二醇氧化还原酶 酶促动力学
分类号: TQ223.162
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 47次
引　用: 1次
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内容摘要


在1,3-丙二醇生物合成途径中,1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原成1,3-丙二醇的反应,该反应是双底物可逆反应。本论文对源于克雷伯氏肺炎杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶的动力学进行了研究,通过结合线型回归和非线性回归方法,对酶促反应的动力学参数进行了求解和模拟。克隆克雷伯氏肺炎杆菌dhaT基因,构建高效表达载体pDK-dhaT在E.coli DH5α中进行高水平异源表达。通过诱导表达后1,3-丙二醇氧化还原酶占菌体总蛋白的39.8%。菌体破碎后,利用硫酸铵沉降法、凝胶层析和阴离子交换层析对酶蛋白进行分离和纯化,最终纯化倍数为3.94,回收率为15.7%,得到了高纯度的1,3-丙二醇氧化还原酶。利用丙烯醛水合法制备1,3-丙二醇氧化还原酶底物3-羟基丙醛,产物利用气相色谱法进行分析。研究结果表明水解反应最适条件为:反应温度50℃,催化剂硫酸浓度为0.25 mol/L,丙烯醛浓度为2 mol/L,反应时间4 h,在此条件下转化率73.42%。1,3-丙二醇氧化还原酶反应符合有序Bi-Bi模型,对于双底物可逆反应,动力学模型包含9个参数:KmA、KmB、Kf、KmP、KmQ、Kr、Keq、Kia和Kiq,首先利用简化模型通过线型回归计算KmA、KmB、Kf、KmP、KmQ和Kr的近似解,接着固定KmA、KmB、Kf、KmP、KmQ和Kr,利用非线性回归计算Keq、Kia和Kip的近似解,最后利用非线性回归计算完整模型的9个参数的精确解。并通过用高浓度底物过程曲线的验证,其模型参数值可信。参数KmA、KmB、Kf、KmP、KmQ、Kr、Keq、Kia和Kiq的精确解分别为:8.47μmol/L、904.31μmol/L、358565.18μmol/（L.min）、487.12μmol/L、461.69μmol/L、769.67μmol/（L.min）、1261.10、2107975.42μmol/L、7810.24μmol/L。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章 绪论  10-22
  1.1 1,3-丙二醇  10-11
    1.1.1 1,3-丙二醇的应用  10-11
    1.1.2 1,3-丙二醇的生产方法  11
  1.2 甘油转化为1,3-丙二醇的代谢途径  11-12
  1.3 1,3-丙二醇氧化还原酶  12-13
  1.4 酶促反应动力学  13-19
    1.4.1 酶促反应动力学的特点  13
    1.4.2 酶的抑制作用模型  13-16
    1.4.3 双底物反应的动力学模型  16-18
    1.4.4 酶促反应动力学参数测定方法  18-19
  1.5 PDOR 酶促动力学反应模型研究现状  19-20
  1.6 选题目的及意义  20
  1.7 研究内容  20-22
第2章 实验方法和材料  22-29
  2.1 实验药品与仪器  22-23
    2.1.1 实验药品  22
    2.1.2 实验仪器  22-23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 Klebsiella pneumonise 基因组DNA 的提取  23-24
    2.2.2 PCR 产物的回收方法  24
    2.2.3 PCR 产物与pMD18–T–Simple 克隆质粒的连接方法  24
    2.2.4 热冲击法转化大肠杆菌  24-25
    2.2.5 无细胞粗提液  25
    2.2.6 酶活分析方法  25
    2.2.7 蛋白质的测定  25-26
    2.2.8 SDS-PAGE 电泳和PDOR 蛋白含量  26
    2.2.9 气相色谱法分析3–HPA  26-27
    2.2.10 醛基总含量测定-色氨酸-盐酸法(Try–HCl)  27
    2.2.11 NADH 和NAD+含量的测定  27
    2.2.12 酶促反应初速度测定  27-29
第3章 PROR 的克隆、表达与纯化  29-42
  3.1 概述  29
  3.2 克隆基因dhaT 并构建表达质粒  29-32
    3.2.1 dhaT 基因的克隆  29-30
    3.2.2 PCR 产物的克隆与测序  30
    3.2.3 dhaT 的表达质粒pDK-dhaT 的构建  30-32
  3.3 PDOR 的表达  32-34
    3.3.1 PDOR 基因dhaT 在E.coli DH5α中表达  32-33
    3.3.2 发酵培养E.coli DH5α(pDK-dhaT)菌体  33-34
  3.4 1,3-丙二醇氧化还原酶的纯化  34-41
    3.4.1 硫酸铵沉淀法  34-35
    3.4.2 凝胶过滤层析  35-37
    3.4.3 阴离子交换层析  37-40
    3.4.4 硫酸铵沉淀-Sephadex G-200-DE23 Cellulose  40-41
  3.5 本章小结  41-42
第4章 丙烯醛水合法制3-羟基丙醛  42-52
  4.1 概述  42-44
    4.1.1 3-羟基丙醛的物理和化学性质  42
    4.1.2 3-HPA 水溶液体系  42-44
  4.2 3-HPA 的制备  44-45
  4.3 气相色谱方法的建立  45-47
    4.3.1 柱子与内标物的选择  45-46
    4.3.2 合成3-HPA 溶液各组分初步定性分析实验  46-47
  4.4 3-HPA 的合成条件优化  47-48
  4.5 萃取提纯3-HPA 实验研究  48-51
    4.5.1 3-HPA 在正丁醇、乙酸乙酯和正己烷中的溶解性  48-49
    4.5.2 3-HPA 在乙酸乙酯和水中的分配  49-50
    4.5.3 反萃实验  50-51
  4.6 结论  51-52
第5章 PDOR 动力学模型的建立及计算  52-71
  5.1 概述  52
  5.2 PDOR 动力学模型建立  52-55
  5.3 PDOR 动力学模型求解方法  55-61
    5.3.1 动力学模型求解步骤  55-57
    5.3.2 实验方法  57-58
    5.3.3 实验  58-61
  5.4 结果与讨论  61-70
    5.4.1 酶浓度与初速度关系  61-63
    5.4.2 正、逆反应非抑制区域的确定  63-65
    5.4.3 PDOR 动力学模型中参数计算  65-69
    5.4.4 PDOR 动力学模型的验证  69-70
  5.5 本章小结  70-71
结论  71-72
参考文献  72-77
攻读硕士学位期间承担的科研任务和主要成果  77-78
致谢  78-79
作者简介  79

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 基本有机化学工业 > 脂肪族化合物（无环化合物）的生产 > 脂肪族醇（醇、羟基化合物）及其衍生物 > 脂肪族醇 > 多元醇 > 二元醇
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