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产1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建及其转化甘油的研究

作　者: 张晓梅
导　师: 诸葛健
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 1,3-丙二醇 甘油 基因工程菌 大肠杆菌 弗氏柠檬杆菌 甘油脱水酶 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶 激活因子 响应面分析法 固定化
分类号: TQ223.162
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 553次
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内容摘要


1,3-丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法,由于从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇还存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题,目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此,利用基因工程技术构建高产菌株备受国内外研究者青睐,被认为是今后的发展方向;本研究的目的是构建新型好氧发酵基因工程菌,提高1,3-丙二醇的产量或转化率,为实现微生物法工业化生产1,3-丙二醇打下基础。本研究首次利用PCR方法从从大肠杆菌中克隆1.16 kb的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD及2.80 kb来源于弗氏柠檬杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB,构建了重组菌E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)。并对重组菌E. coli JM109、E. coli JM109(pEtac-yqhD)、E. coli JM109(pUCtac-dhaB)、E. coli JM109 (pUCtac -dhaB-dhaT)、E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)及C. freundii好氧发酵甘油生产1,3-丙二醇的性能进行了初步考察。结果表明,在E. coli JM109中分别只引入甘油脱水酶dhaB基因或1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶yqhD基因得到的重组菌E. coli JM109(pEtac-yqhD)及E. coli JM109(pUCtac-dhaB)均不能利用甘油合成1,3-丙二醇,只有在E. coli JM109中同时引入dhaB基因和yqhD基因时才能利用甘油转化为1,3-丙二醇,进一步证实1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶可在大肠杆菌体内代替1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇。在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)经IPTG诱导后的1,3-丙二醇产量为28.0 g/L,而E. coli JM109 (pUCtac-dhaB-dhaT) 1,3-丙二醇的产量为8.2 g/L。1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶代替1,3-丙二醇氧化还原酶(编码基因dhaT)催化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇的效率明显提高,然而重组质粒pUCtac-dhaB -yqhD需经IPTG诱导才能表达外源基因,相对工业化生产而言,IPTG较为昂贵,因此解决诱导体系的问题显得尤为重要。本研究采用温控表达载体pHsh构建了产1,3-丙二醇重组菌E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD),并对重组菌E. coli JM109 (pUCtac-dhaB-yqhD)和E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)发酵生产1,3-丙二醇的性能进行了初步考察。结果表明,温度诱导与IPTG诱导相比1,3-丙二醇的产量无显著差别,在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E. coli JM109(pUCtac-dhaB -yqhD)与E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)经诱导后1,3-丙二醇的产量分别为28.4 g/L及26.5 g/L。因此,利用温控载体构建产1,3-丙二醇重组菌有利于降低1,3-丙二醇的生产成本。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章 绪论  13-33
  1.1 1,3-丙二醇的性质及应用领域  13-14
  1.2 1,3-丙二醇的生产及市场情况  14
  1.3 1,3-丙二醇的生产方法  14-15
  1.4 微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究进展  15-24
    1.4.1 生产菌种  15
    1.4.2 1,3-丙二醇生物合成途径  15-17
    1.4.3 1,3-丙二醇生物合成途径中的关键酶  17-21
    1.4.4 基因工程研究  21-24
  1.5 底物和产物对细胞生长抑制作用的研究  24-26
    1.5.1 底物和产物对细胞生长的抑制作用及其与代谢的关系  24-25
    1.5.2 包埋法在提高重组菌耐受性方面的应用  25-26
  1.6 展望  26
  1.7 立题意义和本论文的研究内容  26-27
    1.7.1 立题意义  26
    1.7.2 研究内容  26-27
  参考文献  27-33
第二章 产1,3-丙二醇重组菌 E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)的构建  33-49
  2.1 材料与方法  34-40
    2.1.1 菌株和质粒  34
    2.1.2 主要仪器  34
    2.1.3 工具酶和试剂  34-36
    2.1.4 培养基  36
    2.1.5 分子克隆技术  36-38
    2.1.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析  38-39
    2.1.7 酶活力测定方法  39-40
    2.1.8 E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)质粒稳定性分析  40
    2.1.9 重组菌发酵实验  40
  2.2 结果与讨论  40-46
    2.2.1 含甘油脱水酶基因dhaB 的重组质粒pUCtac-dhaB 的构建  40-41
    2.2.2 甘油脱水酶基因dhaB 的核苷酸序列分析  41
    2.2.3 含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD 的重组质粒pEtac-yqhD 的构建  41-42
    2.2.4 1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD 的核苷酸序列分析  42
    2.2.5 重组质粒pUCtac-dhaB-yqhD 的构建  42-44
    2.2.6 重组菌全细胞蛋白 SDS-PAGE 电泳分析  44-45
    2.2.7 酶活力分析  45
    2.2.8 E. coli JM109(pUCtac-dhaB-yqhD)质粒稳定性分析  45
    2.2.9 重组菌发酵验证实验  45-46
  2.3 本章小结  46-47
  参考文献  47-49
第三章 产1,3-丙二醇重组菌 E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的构建  49-57
  3.1 材料与方法  49-50
    3.1.1 菌株和质粒  49
    3.1.2 培养基  49
    3.1.3 工具酶和试剂  49
    3.1.4 主要仪器  49
    3.1.5 培养方法  49
    3.1.6 分子克隆技术  49-50
    3.1.7 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析  50
    3.1.8 酶活力测定方法  50
    3.1.9 E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)质粒稳定性分析  50
    3.1.10 重组菌发酵实验  50
  3.2 结果与讨论  50-55
    3.2.1 含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD 的重组质粒pHsh-yqhD 的构建  50-51
    3.2.2 重组质粒pHsh-dhaB-yqhD 的构建  51-53
    3.2.3 酶活力分析  53
    3.2.4 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析  53
    3.2.5 E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)质粒稳定性分析  53-54
    3.2.6 重组菌初步发酵实验  54
    3.2.7 维生素812 对E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)发酵结果的影响  54-55
  3.3 本章小结  55-56
  参考文献  56-57
第四章 甘油脱水酶激活因子的编码基因dhaG 和dhaF 的克隆及与pHsh-dhaB-yqhD 的串联表达  57-66
  4.1 材料与方法  57-59
    4.1.1 菌株和质粒  57
    4.1.2 培养基  57
    4.1.3 工具酶和试剂  57
    4.1.4 主要仪器  57
    4.1.5 培养方法  57
    4.1.6 分子克隆技术  57-59
    4.1.7 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF-dhaB 的构建  59
    4.1.8 酶活力测定方法  59
    4.1.9 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析  59
    4.1.10 E. coli JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF -yqhD)质粒稳定性分析  59
  4.2 结果与讨论  59-64
    4.2.1 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG 的构建  59-60
    4.2.2 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF 的构建  60-62
    4.2.3 重组质粒pHsh-yqhD-dhaG-dhaF-dhaB 的构建  62-63
    4.2.4 甘油脱水酶激活因子编码基因dhaG 与dhaF 的核苷酸序列分析  63
    4.2.5 酶活力分析  63
    4.2.6 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析  63-64
    4.2.7 E. coli JM109(pHsh -dhaB -dhaG-dhaF-yqhD)质粒稳定性分析  64
  4.3 本章小结  64-65
  参考文献  65-66
第五章 重组菌 E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD-dhaG-dhaF)发酵培养基优化  66-79
  5.1 材料与方法  66-68
    5.1.1 菌株  66-67
    5.1.2 培养基和培养条件  67
    5.1.3 Box-Behnken 中心组成实验设计优化培养基组成  67-68
  5.2 结果与讨论  68-77
    5.2.1 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响  68
    5.2.2 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响  68-69
    5.2.3 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响  69
    5.2.4 维生素B_(12) 浓度对重组菌发酵的影响  69-70
    5.2.5 Box-Behnken 实验设计优化重组菌的发酵培养基  70-76
    5.2.6 5 L 发酵罐上重组菌的发酵特性  76-77
  5.3 本章小结  77
  参考文献  77-79
第六章 重组菌 E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD-dhaG-dhaF)的固定化研究  79-88
  6.1 材料与方法  79-81
    6.1.1 菌株  79
    6.1.2 培养基  79
    6.1.3 主要试剂  79-80
    6.1.4 主要仪器  80
    6.1.5 发酵方法  80
    6.1.6 检测方法  80-81
  6.2 结果与讨论  81-86
    6.2.1 固定化细胞诱导时间的确定  81
    6.2.2 正交优化试验结果与分析  81-82
    6.2.3 营养因子对重组菌固定化发酵生产1,3-丙二醇的影响  82-85
    6.2.4 重组菌固定化细胞的稳定性  85-86
  6.3 本章小结  86
  参考文献  86-88
主要结论  88-90
创新点  90-91
攻读博士学位期间发表的论文  91-92
致谢  92-93
主要符号对照表  93

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 基本有机化学工业 > 脂肪族化合物（无环化合物）的生产 > 脂肪族醇（醇、羟基化合物）及其衍生物 > 脂肪族醇 > 多元醇 > 二元醇
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