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黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建与稳定性研究

作　者: 金波
导　师: 陈集双
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄瓜花叶病毒卫星RNA 克隆测序体外转录体外重组:寄主反应杂交检测变异进化人工合成 DNA改组
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

随着新的RNA病毒的不断出现，人们对RNA病毒的适应性变异问题越来越关注。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)卫星RNA作为一类与植物病毒相关的特殊的RNA因子，是基因组最小、生物学功能最简单的分子体系，因而被越来越多的研究者用作研究RNA病毒变异的良好模型。本研究通过卫星RNA的基因克隆和序列比较，利用体外转录和体外重组技术的建立，并通过构建卫星RNA人工突变体，实现了卫星RNA基因变异规律和进化趋势的摸索。研究结果如下：在杭州郊区田间的辣椒植株上分离获得了2株CMV毒株，经dsRNA分析发现均具有典型的卫星RNA条带，并通过RT-PCR获得卫星RNA的全序列。经过序列分析，发现来自HZ03P09分离物的satC336由336个核苷酸组成，来自HZ03P10分离物satC382由382个核苷酸组成。对47个来自不同地区和寄主来源的卫星RNA序列进行同源性分析，发现CMV卫星RNA的序列同源性与地区分布有一定的关联，与其大小、寄主来源等没有明确的关联性。卫星RNA序列之间表现出较大的变异性，卫星RNA的5′端80个碱基和3′端的200个碱基为高度保守区，变异主要发生在几个集中的区域内，变异区内2／3的卫星RNA具有连续的碱基插入或缺失，点变异的碱基或位点在所有卫星RNA中基本相同。由同源性比较结果推断，CMV卫星RNA的最长理论长度至少为425nt，具有人为加长的可能性，而目前的小卫星RNA基本已达到了理论最小。在5′端添加了T7启动子的PCR产物作为DNA模板，体外转录获得侵染性CMV卫星RNA，通过转录产物与CMV基因组RNA的混合接种建立体外重组技术，并对不同的黄瓜花叶病毒毒株与不同卫星RNA之间的相互选择关系进行了研究。2株CMV病毒分离物CFq和CNa，分别与satRNA satY369进行体外重组，结果显示CNa可支持satY369的复制，而CFq不支持satY369。4个不同来源的卫星RNA(satY369、satY385、satC336和satC382)分别与CNa进行重组，结果表明：CNa可使satY369、satY385、和satC382达高拷贝量并与之稳定共存，但不能稳定支持satC336。2个卫星(satY369、satY385)同时与CNa进行重组，结果表明仅satY369可与CNa稳定共存，而且satY369与CNa的假重组组合(NY)在5种寄主植物内可长期共存，遗传稳定。由此可见，satRNA依赖CMV进行复制的选择关系，不仅与CMV毒株有关，而且与satRNA本身的序列和空间结构有直接关系。为了解卫星RNA对辅助病毒的影响，通过测定CNa和NY(satY369与CNa的摘要重组毒株)这2个病毒株的寄主反应，结果发现:satY369能明显减弱CNa对大部分寄主植物的症状，尤其是对西葫芦的减弱作用最明显。用RNA点杂交法定量分析寄主植物中CMV的基因组RNA3及satRNA的相对含量变化，结果显示:在26℃条件下，分别定量接种CNa和NY于心叶烟，接种sd、1 od、1 sd、20d、25d和30d时，二者基因组RNA3含量均呈下降趋势，在相应的时间内NY-RNA3含量均低于CNa-RNA3的含量;接种1 od，NY与CNa的寄主适应性没有显著差异，新毒株NY的基因组RNA3在六种寄主植物中的相对含量依次为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗，其卫星RNA一satY369在寄主中的相对含量则表现为假酸浆>心叶烟>番茄>曼陀罗>西葫芦>南瓜。由此可以看出，卫星RNA一satY369降低了CMV基因组RNA3在寄主中的含量，而且随着接种时间的增加，satY369的对CMV的作用达到平衡期;satY369没有改变CMV基因组RNA3的寄主适应性，而且症状改变与降低基因组RNA含量间没有明确的相关性。根据以上结果，以satY369为模板，设计了理论最大和理论最小卫星RNA。理论最大卫星RNA Max由421个核普酸组成，理论最小卫星RNA而n由330个核昔酸组成。人工合成片段通过PCR扩增整合，经限制性内切酶酶切和连接酶连接，构建获得插入有理论卫星全基因的质粒pM和pm。将理论卫星与CNa进行体外重组，结果表明:理论卫星RNA不能以CNa为辅助病毒进行有效的复制和装配。当理论卫星与NY进行体外重组，发现在satY369存在时，理论卫星在寄主中略有扩散，但无法长距离传播;理论卫星与satY369不发生重组。由于本实验中理论卫星与其他CMV毒株未进行假重组实验，因而其他CMV毒株对理论卫星RNA的支持能力还没有证据证实。本研究还利用DNA改组技术，获得4株点突变株—MS一l(巧A~G)、MS一12 (304A~G)、MS一32(304A一T)和MS一34(163G一A)。通过体外重组的方法，对基于卫星RNAsatY369产生的4株突变株的体外进化进行了研究。研究结果表明，在卫星RNA的高度保守区域突变的突变株MS一l、MS一12和MS一犯均丧失生物活性，而变异区中的变异株MS一34突变仍然具有生物活性:从而证实DNA改组技术与体外重组技术的组合可模拟卫星RNA的体内变异和进化。

全文目录

摘要  13-15
Abstract  15-18
第一章文献综述:黄瓜花叶病毒卫星RNA 变异与进化的研究进展  18-30
  1.1 RNA病毒变异与进化的研究概况  18-21
    1.1.1 RNA病毒的类型  18-19
    1.1.2 RNA病毒的复制与转录  19
    1.1.3 RNA病毒的进化  19-20
    1.1.4 植物病毒是研究RNA病毒进化的良好模型  20-21
  1.2 植物病毒进化研究的概况  21-22
    1.2.1 植物病毒的起源  21
    1.2.2 植物病毒进化的原因  21-22
  1.3 黄瓜花叶病毒的研究进展  22-25
    1.3.1 黄瓜花叶病毒的基因组及其功能  22-23
    1.3.2 黄瓜花叶病毒引起的病害  23-24
    1.3.3 黄瓜花叶病毒的变异与进化  24-25
  1.4 黄瓜花叶病毒卫星RNA的研究进展  25-28
    1.4.1 卫星RNA及其与辅助病毒的关系  25-26
    1.4.2 卫星RNA的起源  26
    1.4.3 CMV卫星RNA的结构  26-27
    1.4.4 卫星RNA的变异和进化  27-28
  1.5 DNA改组技术和体外分子进化  28-29
  1.6 研究目的和内容  29-30
第二章黄瓜花叶病毒卫星RNA的克隆及序列分析  30-41
  2.1 材料与方法  30-36
    2.1.1 病毒分离物  30
    2.1.2 酶与试剂  30-31
    2.1.3 病毒dsRNA的提取和分析  31
    2.1.4 RNA模板制备  31
    2.1.5 引物设计  31
    2.1.6 RT-PCR扩增  31-32
    2.1.7 试剂盒回收目的片段  32-33
    2.1.8 连接反应  33
    2.1.9 重组质粒的转化  33
    2.1.10 重组质粒的筛选和制备  33-34
    2.1.11 重组质粒的鉴定  34
    2.1.12 序列测定及分析  34-36
  2.2 结果和分析  36-39
    2.2.1 CMV分离物的dsRNA分析结果  36
    2.2.2 卫星RNA的RT-PCR扩增结果  36-37
    2.2.3 重组质粒的筛选  37
    2.2.4 重组质粒的PCR鉴定  37
    2.2.5 序列测定结果  37-38
    2.2.6 卫星RNA序列分析结果  38-39
  2.3 小结与讨论  39-41
第三章黄瓜花叶病毒与卫星RNA体外重组方法的建立及其选择关系的研究  41-49
  3.1 材料与方法  41-43
    3.1.1 病毒分离物  41-42
    3.1.2 酶与试剂  42
    3.1.3 寡核苷酸引物  42
    3.1.4 病毒侵染植株中总RNA的提取  42
    3.1.5 病毒dsRNA分析和RT-PCR检测卫星RNA  42
    3.1.6 卫星RNA的体外转录  42-43
    3.1.7 卫星RNA与CMV的体外重组  43
    3.1.8 假重组毒株稳定性检验  43
  3.2 结果与分析  43-46
    3.2.1 2株CMV分别与satY369体外重组的结果  43-44
    3.2.2 4个卫星RNA分别与CMV-CNa体外重组的结果  44-45
    3.2.3 两个卫星RNA同时与CNa进行体外重组的结果  45-46
    3.2.4 假重组毒株在不同寄主植物中dsRNA的检测结果  46
  3.3 小结与讨论  46-49
第四章卫星RNA对黄瓜花叶病毒的影响  49-59
  4.1 材料与方法  49-51
    4.1.1 病毒分离物与质粒  49-50
    4.1.2 试剂  50
    4.1.3 病毒接种  50
    4.1.4 RNA模板的变性和点样  50
    4.1.5 Cy5标记DNA探针的制备  50-51
    4.1.6 玻片杂交  51
    4.1.7 扫描与数据处理  51
    4.1.8 不同接种时间RNA3和卫星RNA相对含量的分析  51
    4.1.9 不同寄主中CMV基因组RNA3和卫星RNA相对含量的分析  51
  4.2 结果与讨论  51-57
    4.2.1 NY和CNa之dsRNA及RT-PCR分析结果  51-52
    4.2.2 NY和CNa的寄主症状反应  52-54
    4.2.3 不同接种时间RNA3和卫星RNA相对含量的比较  54-55
    4.2.4 不同寄主中RNA3和卫星RNA相对含量的比较  55-57
    4.2.5 卫星RNA对CMV-CNa基因组RNA3相对含量的影响  57
  4.3 小结与讨论  57-59
第五章黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体  59-70
  5.1 材料与方法  60-63
    5.1.1 质粒和病毒分离物  60
    5.1.2 酶与试剂  60
    5.1.3 理论卫星的设计  60-61
    5.1.4 PCR拼接DNA片段  61
    5.1.5 理论卫星质粒的构建  61-62
    5.1.6 重组质粒的筛选  62-63
    5.1.7 理论卫星RNA与CMV基因组的假重组  63
    5.1.8 理论卫星RNA的稳定性分析  63
    5.1.9 序列测定和分析  63
  5.2 结果与分析  63-69
    5.2.1 理论最大、最小卫星的设计结果  63-64
    5.2.2 理论最大、最小卫星DNA的拼接  64-65
    5.2.3 理论全长最大最小卫星DNA质粒的构建  65
    5.2.4 序列分析  65-67
    5.2.5 理论卫星RNA与CNa的假重组  67
    5.2.6 理论卫星RNA与CNa的假重组毒株在不同寄主中的dsRNA分析  67
    5.2.7 理论卫星RNA和CNY(satY369+CNa)的假重组  67-69
  5.3 小结与讨论  69-70
第六章利用DNA改组技术构建卫星RNA突变体  70-77
  6.1 材料与方法  70-73
    6.1.1 质粒和病毒分离物  70
    6.1.2 主要试剂  70-71
    6.1.3 DNA改组程序  71-72
    6.1.4 卫星DNA突变子的筛选  72
    6.1.5 突变子的侵染性分析  72-73
    6.1.6 序列分析  73
  6.2 结果与分析  73-75
    6.2.1 从质粒psatY用普通Taq酶进行PCR反应  73
    6.2.2 DNase Ⅰ降解  73-74
    6.2.3 突变子的筛选  74-75
    6.2.4 卫星突变子的侵染性实验  75
    6.2.5 序列分析  75
  6.3 小结与讨论  75-77
总讨论  77-79
参考文献  79-85
附件: 重要溶液的配制  85-86

黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建与稳定性研究

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