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衣藻FAB2基因分离和功能鉴定以及不同胁迫条件下表达模式研究

作　者: 郭雪洁
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 莱茵衣藻 Δ9脂肪酸去饱和酶实时荧光定量PCR GC-MS
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

不饱和脂肪酸是机体生物膜的重要组成成分,对生物膜结构、机能、相转变、通透性的调节及相关过程的调控有重要作用。它还参与细胞生物化学反应、转运过程和细胞应激反应,影响脂肪代谢、寻靶作用、免疫反应、耐寒、抗氧化等生理过程。此外,不饱和脂肪酸还是哺乳动物体内生成前列腺素、凝血哑烷和白三烯等激素的前体,具有提高人体免疫力、预防心血管疾病和癌症等重要的生理功能。海洋微藻中富含多不饱和脂肪酸,脂肪酸去饱和酶是催化不饱和脂肪酸合成的酶,它催化与载体结合的饱和或不饱和脂肪酸在脂肪酸链上形成双键。环境因素(如温度、光照等)可通过某些分子机理来实现对去饱和酶的表达及其活性调控,使细胞得以迅速改变脂肪酸的组成来适应环境的变化。微藻Δ9脂肪酸去饱和酶是合成不饱和脂肪酸的第一个关键酶。所以对基础研究有很大的价值。本论文分离了模式绿藻莱茵衣藻中Δ9脂肪酸去饱和酶基因(FAB2),并尝试对该基因功能进行初步研究。主要开展了以下研究工作:1、用分子生物学方法分离了目标基因衣藻FAB2,预测了其编码蛋白质的相关特性,系统发育进化分析结果发现与高等植物的FAB2基因具有很高的同源性。2、构建了FAB2基因的异源原核表达载体,并将目标基因在大肠杆菌BL21中进行了高效表达。3、研究了不同胁迫条件下莱茵衣藻FAB2基因的表达模式:初步发现低温和高盐胁迫能够促进该基因表达。选取几个合适的温度和盐度梯度对对数期的莱茵衣藻进行诱导,应用实时荧光定量PCR技术进行基因相对表达量测定,初步发现低温和高盐胁迫下基因表达量均有一定程度升高。4、尝试进行聚球藻7942ΔDesC突变株构建并将目标基因转化该突变株并进行功能鉴定。本论文初步说明温度、盐度变化可能影响到了莱茵衣藻FAB2基因的表达,即该基因在莱茵衣藻应答不同温度、盐度外界环境刺激时起了一定作用,理论上为明确微藻低温适应、高盐适应的分子机理奠定了基础,同时对进一步开展其他脂肪酸去饱和酶的研究提供示例。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章引言  10-36
  第一节微藻脂肪酸去饱和酶基因研究进展  10-25
    1 不饱和脂肪酸的功能及生物合成  10-19
      1.1 不饱和脂肪酸的分类  10-11
      1.2 不饱和脂肪酸的生理功能  11-16
      1.3 不饱和脂肪酸的生物合成途径  16-19
    2 脂肪酸去饱和酶的分类及其特性  19-21
      2.1 脂肪酸去饱和酶的分类  19
      2.2 脂肪酸去饱和酶的特性  19-21
    3 微藻脂肪酸去饱和酶的研究  21-25
  第二节实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平  25-30
    1 实时荧光定量PCR的原理  25-26
    2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类  26-29
      2.1 染料法  26-27
      2.2 探针法  27-29
    3 实时荧光定量PCR 技术的应用  29-30
  第三节蓝藻的遗传操作  30-34
    1 蓝藻的基因转移系统  30-33
      1.1 遗传转化  30-31
      1.2 接合转移  31-32
      1.3 其他  32-33
    2 蓝藻的质粒载体  33
    3 不同蓝藻株系最适的基因转移系统  33-34
  第四节本论文的研究目的及意义  34-36
第二章莱茵衣藻FAB2 基因分离和序列分析以及异源原核表达  36-53
  1 材料和方法  37-46
    1.1 材料  37-39
    1.2 方法  39-46
  2 结果与分析  46-52
    2.1 目的片段FAB2 cDNA 的克隆及验证  46-47
    2.2 莱茵衣藻FAB2 基因的异源原核表达  47
    2.3 与其他真核藻类及高等植物的氨基酸多序列比对分析  47-49
    2.4 蛋白质二级结构预测  49-50
    2.5 编码蛋白的生化特性分析  50-51
    2.6 系统发育分析  51-52
  3 讨论  52-53
第三章莱茵衣藻FAB2 基因不同胁迫条件下表达模式研究  53-65
  1 材料和方法  53-57
    1.1 材料  53-54
    1.2 实验方法  54-57
  2 结果与分析  57-63
    2.1 不同培养条件下莱茵衣藻生长曲线  57-58
    2.2 定量PCR 引物验证  58-62
    2.3 莱茵衣藻FAB2 不同胁迫条件下的表达特征  62-63
  3 讨论  63
  4 本章小结  63-65
第四章莱茵衣藻FAB2 基因功能鉴定  65-78
  第一节聚球藻PCC7942ΔDesC 突变株的构建  65-74
    1 材料和方法  65-71
      1.1 材料  65-67
      1.2 方法  67-71
    2 结果与分析  71-74
      2.1 聚球藻PCC7942 基因组DNA提取，DesC基因上下游片段及卡那抗性基因扩增  71
      2.2 同源重组载体的鉴定  71-72
      2.3 聚球藻转化子的获得  72-73
      2.4 聚球藻转化子的检测  73-74
    3 讨论  74
  第二节莱茵衣藻FAB2 基因体内活性测定  74-78
    1 材料和方法  74-76
      1.1 材料  74-75
      1.2 方法  75-76
    2 结果与分析  76-77
    3 讨论  77-78
结论  78-79
参考文献  79-86
发表及完成文章  86-87
致谢  87

衣藻FAB2基因分离和功能鉴定以及不同胁迫条件下表达模式研究

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