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TcLr19与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA文库构建及TaTCTP表达分析

作　者: 张立峰
导　师: 王冬梅
学　校: 河北农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: SMART技术 同源重组 酵母双杂交 cDNA文库 RT-PCR 小麦 翻译控制肿瘤蛋白 实时荧光定量PCR 原核表达 Western Blotting
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分TcLr19与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA文库构建小麦与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA文库的构建,对于研究小麦与叶锈菌互作体系中的蛋白质与蛋白质、蛋白质与RNA、蛋白质与小分子等的相互作用有着重要意义。本试验以小麦近等基因系TcLr19和叶锈菌生理小种366为材料,二者形成不亲和组合,分别在接种后4,8,12 h取材,采用SMART (Switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,以小麦叶片mRNA为模板,分别用Oligo (dT)18 Primer和Random Primer反转录合成cDNA第一链,通过同源重组的方法,在酵母菌株Y187中构建了两个小麦近等基因系TcLr19与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA文库。经过检测,文库的转化率分别为1.32×106转化子/ 3μg pGADT7-Rec和1.0×106转化子/ 3μg pGADT7-Rec,文库滴度分别为2.62×108 pfu/ mL和3.51×108 pfu/ mL,重组率分别为93%和100%。经检验证实,构建的两个文库具有很好的多样性,基因长度分布比较均匀,文库效价均≥1. 0×106,完全可以应用于蛋白质相互作用的大规模筛选,该文库的构建为下一步筛选互作蛋白,分离和确定更多的信号转导组件,研究抗病蛋白的结构及功能,建立更完善的小麦抗叶锈信号转导网络奠定了基础。这对于我们深入了解小麦抗叶锈病的分子机制,克隆小麦抗叶锈重要相关基因及利用基因工程培育新的抗叶锈小麦品种具有重要意义。第二部分TaTCTP在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP),是一种高度保守的、高表达的真核蛋白家族,广泛存在于动物、植物及酵母中,并具有高度的同源性。大量的研究表明:TCTP是一种多功能蛋白,尤其在复杂的生命活动中具有极其重要的作用。最初认为TCTP是一类生长相关蛋白,近年大量的研究结果提示TCTP可能具有非常重要的生物学功能,包括组胺释放功能、微管结合蛋白、钙结合蛋白、抗凋亡作用、调节细胞周期的进程和恶性转移、抑制Na+、K+-ATPase活性、抗氧化、具有分子伴侣活性的热激蛋白及抗疟疾作用等。本实验室长期以来从事小麦(Triticum aestivum L.)抗叶锈菌(Puccinia triticina)侵染生理机制的研究工作,已经初步证明Ca2+、ROS和细胞骨架等参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的信号转导过程;并通过抑制性差减杂交技术,构建了TcLr19抗叶锈HR反应早期的差异基因表达文库,在该文库中发现TCTP基因在接菌后8h和16h时大量表达。结合目前对TCTP的研究进展,初步判断TaTCTP可能参与了小麦对叶锈菌的抗性反应。为了进一步探讨TaTCTP的功能,有必要制备TaTCTP的特异性抗体,因为它在蛋白质的定位、定量分析及生理功能研究中是最有效、最特异的材料。本试验首先根据已知序列,以小麦近等基因系TcLr19叶片cDNA为模板,扩增获得了小麦翻译控制肿瘤蛋白基因TaTCTP,构建到表达载体pET30a(+)-GST中并将其转化大肠杆菌。利用大肠杆菌表达系统,通过IPTG诱导表达TaTCTP融合蛋白。经筛选获得该蛋白的最佳诱导表达条件: LB培养基37℃培养至菌体OD600=0.5~0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,28℃诱导20h。进一步利用Ni-NTA纯化了TaTCTP融合蛋白,经SDS-PAGE分离后由考马斯亮蓝染色证明已除去大部分杂蛋白,测定蛋白质浓度约为1.3 mg/mL,达到了抗体制备的要求。以纯化的TaTCTP融合蛋白为抗原,免疫新西兰兔制备了抗小麦翻译控制肿瘤蛋白的兔抗血清。TaTCTP兔抗血清的获得为进一步探讨TaTCTP在小麦与叶锈菌互作过程中的时空分布特征及功能奠定了基础。以小麦TcLr19接菌366后不同时间点叶片为材料,采用实时荧光定量PCR检测TaTCTP基因在mRNA水平的表达变化,Western blotting检测TaTCTP蛋白的表达量变化。试验结果表明,小麦近等基因系TcLr19接种叶锈菌小种366后,TaTCTP mRNA表达量在接种后2 h时表现上调表达,并随互作时间的延长,表达量逐渐上升并在24h时达到最大;而未接种对照中,TaTCTP mRNA的表达量变化不明显。从Western blotting结果来看,所制备的抗体对小麦全蛋白质具有很高的特异性,获得的信号基本上呈现一条比较清晰的主带。但无论是接菌处理还是未接种对照处理,TaTCTP在蛋白水平的表达量变化均无明显区别。以上结果表明TaTCTP在转录水平受叶锈菌侵染的诱导,TaTCTP可能在小麦抗叶锈病的分子机制中发挥一定作用,其具体功能还有待进一步试验证明。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-14
第一部分 TcLr19 与叶锈菌互作早期的酵母双杂交cDNA 文库构建  14-31
  1 引言  14-16
  2 材料与方法  16-23
    2.1 主要仪器及供试材料  16-17
      2.1.1 试验仪器  16
      2.1.2 供试试剂  16
      2.1.3 植物材料及菌种  16
      2.1.4 供试小麦幼苗的培养与接种  16
      2.1.5 试验涉及的培养基  16-17
    2.2 总RNA 提取和双链cDNA 的合成  17-19
      2.2.1 TcLr19 的培养和取样  17
      2.2.2 总RNA 提取与检测  17-18
      2.2.3 双链cDNA 的合成  18-19
    2.3 双链cDNA 的纯化(CHROMA SPIN~(TM)TE- 400 Column 柱分离法)  19-20
    2.4 同源转化酵母菌株Y187  20-21
      2.4.1 制备酵母感受态细胞  20
      2.4.2 转化酵母菌株Y187  20-21
    2.5 在SD/-Leu 培养基上筛选转化菌株  21
    2.6 文库插入片段大小检测  21-23
  3 结果与分析  23-26
    3.1 总RNA 的提取及检测  23
    3.2 双链cDNA 的合成及纯化  23-24
    3.3 文库的鉴定  24-26
      3.3.1 文库的转化效率  24
      3.3.2 文库的保存及滴度的测定  24
      3.3.3 文库重组比的鉴定  24-26
  4 讨论  26-28
    4.1 建立酵母双杂交cDNA 文库的必要性  26
    4.2 优质酵母文库是进一步研究小麦抗叶锈病分子机制的基础  26-27
    4.3 低丰度cDNA 克隆  27-28
  5 结论  28-29
  参考文献  29-31
第二部分 TaTCTP 在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析  31-68
  1 引言  31-34
  2 材料与方法  34-50
    2.1 主要仪器及供试材料  34-35
      2.1.1 试验仪器  34
      2.1.2 供试试剂  34
      2.1.3 材料  34
      2.1.4 供试小麦幼苗的培养与接种  34-35
      2.1.5 试验涉及的培养基  35
      2.1.6 Western blotting 涉及的试剂  35
    2.2 TaTCTP 基因的PCR 扩增与表达载体的构建  35-41
      2.2.1 总RNA 提取和cDNA 第一链的合成  35-37
      2.2.2 引物设计  37
      2.2.3 TaTCTP 基因的PCR 扩增与表达载体的构建  37-41
    2.3 TaTCTP 的原核表达  41-42
      2.3.1 TaTCTP 的原核表达条件的探索  41
      2.3.2 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达  41-42
    2.4 TaTCTP 特异性的抗体制备与鉴定  42-45
      2.4.1 TaTCTP 融合蛋白的大量诱导表达及SDS-PAGE 检测  42-43
      2.4.2 TaTCTP 融合蛋白的纯化及SDS-PAGE 检测  43
      2.4.3 TaTCTP 融合蛋白抗血清的制备  43-44
      2.4.4 抗血清中抗体效价的检测  44
      2.4.5 抗血清鉴定  44-45
      2.4.6 小麦样品中总的可溶性蛋白的提取  45
    2.5 小麦TaTCTP 基因受叶锈菌侵染后的表达谱变化  45-50
      2.5.1 小麦受叶锈菌侵染后TaTCTP 基因在mRNA 水平的表达变化  45-49
      2.5.2 小麦受叶锈菌侵染后TaTCTP 基因在蛋白水平的表达变化  49-50
  3 结果与分析  50-63
    3.1 TaTCTP 基因的PCR 扩增与表达载体的构建  50-53
      3.1.1 总RNA 完整性鉴定和RNA 浓度及纯度测定  50-51
      3.1.2 TaTCTP 基因的PCR 扩增  51
      3.1.3 表达载体构建  51-53
    3.2 TaTCTP 的原核表达  53-55
    3.3 小麦 TaTCTP 抗血清的制备及鉴定  55-57
      3.3.1 TaTCTP 融合蛋白的纯化  55
      3.3.2 TaTCTP 抗血清的制备  55-56
      3.3.3 TaTCTP 抗血清的鉴定  56-57
    3.4 小麦TaTCTP 基因应答叶锈菌侵染的转录本表达特征  57-62
      3.4.1 内参基因小麦actin 的实时荧光定量检测  57-60
      3.4.2 TaTCTP 的实时荧光定量检测  60-62
    3.5 小麦TaTCTP 基因应答叶锈菌侵染后在蛋白水平的变化  62-63
  4 讨论  63-67
    4.1 开展TaTCTP 功能研究的必要性  63
    4.2 TaTCTP 基因的原核表达及抗体制备  63-65
      4.2.1 载体选择的重要性  63-64
      4.2.2 IPTG 诱导重组蛋白表达条件的优化  64
      4.2.3 重组蛋白纯化过程中的一些问题  64
      4.2.4 抗血清特异性检测的必要性  64-65
    4.3 TaTCTP 基因应答叶锈菌刺激的表达谱分析  65-67
  5 结论  67-68
参考文献  68-73
在读期间发表的学术论文  73-74
作者简历  74-75
致谢  75-76

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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