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重组腈水解酶的发酵优化及固定化技术研究

作　者: 刘俊峰
导　师: 许建和
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 腈水解酶发酵优化重组大肠杆菌分批补料培养细胞固定化扁桃腈 (R)-(-)-扁桃酸
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

腈水解酶(简称腈酶)在有机合成及环境保护等领域有着十分广泛的应用。利用高对映选择性腈酶催化生产的单一构型精细化工产品具有广阔的市场和较高的附加值。光学纯的扁桃酸单一对映体,作为腈酶催化合成的产物之一,不仅是合成头孢类抗生素、血管扩张药环扁桃酸酯等药物的重要中间体,而且是合成红古豆醇酯、乙酰基扁桃酰氯和苦杏仁酸乙醇胺等化工产品的合成“砌块”。然而商业化的腈酶十分有限,极大地限制了腈酶的应用。本文对含有腈酶基因的重组E. coli JM109发酵过程进行了系统而深入的研究,同时还探讨了大肠杆菌整细胞的固定化技术及其催化扁桃腈水解生产（R)-(-)-扁桃酸的应用。在对重组E. coli JM109菌株进行了发酵优化的过程中,分别对培养基成分、诱导剂种类、诱导条件、发酵pH、发酵温度等过程参数进行了考察。结果表明,在37℃、初始pH 7.0的分批培养条件下,接种后4h加入终浓度为0.2 mM的IPTG进行诱导,可以获得最高的酶产量,并且用该腈酶催化扁桃腈水解所得的(R)-(-)-扁桃酸的对映体过量值(ee)>95%。在此基础上,通过甘油补料分批培养可以将酶产量再次提高4倍。并且其细胞量、腈酶的比活力和体积产量比发酵优化前分别提高了9.0倍、5.5倍和50倍。这些结果通过凝胶电泳分析得到了进一步证实。在发酵优化的基础上,对含有腈酶的大肠杆菌整细胞固定化技术进行了研究,分别用海藻酸钙凝胶包埋法和包埋-交联相结合的方法对细胞进行固定化,并且优化了固定化工艺中的细胞用量、海藻酸钠浓度、保存方法以及聚乙烯亚胺(PEI)处理时间等主要参数。实验表明,凝胶包埋细胞对高浓度扁桃腈的耐受性与游离细胞相比有了明显提高,并且重复使用19批后,转化率仍可保持39.8%；其生产率为2.37 g扁桃酸/g湿细胞(wcw),是游离细胞利用率的1.9倍。用PEI与戊二醛(GA)交联的凝胶包埋细胞具有优良的热稳定性。在60℃条件下,交联后的凝胶包埋细胞半衰期为194 mmin,是交联之前的2.5倍、游离细胞的6.0倍。最后,利用3.0 g凝胶包埋细胞和3.15 g交联后的凝胶包埋细胞,制备获得(R)-(-)-扁桃酸1.62 g,产物得率为60.8%,光学纯度为98.2%ee。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章文献综述  10-22
  1.1 手性化合物与生物催化简介  10-12
    1.1.1 手性化合物简介  10
    1.1.2 生物催化简介  10-12
  1.2 腈水解酶研究概况  12-16
    1.2.1 腈水解酶简介  12-14
    1.2.2 腈酶在有机合成中的应用  14-16
  1.3 重组大肠杆菌表达外源蛋白及高密度培养研究概况  16-21
    1.3.1 利用大肠杆菌生产重组蛋白  16-20
      1.3.1.1 在细胞质中表达重组蛋白  18-19
      1.3.1.2 在细胞周质中表达重组蛋白  19
      1.3.1.3 在细胞外表达重组蛋白  19-20
    1.3.2 重组大肠杆菌高密度培养研究概况  20-21
  1.4 本课题的研究意义及内容  21-22
第2章重组腈酶的发酵优化  22-41
  2.1 前言  22-23
  2.2 材料与方法  23-26
    2.2.1 试剂  23
    2.2.2 菌种来源及保存方法  23
      2.2.2.1 菌种来源  23
      2.2.2.2 保存方法  23
    2.2.3 培养基  23
      2.2.3.1 种子培养基  23
      2.2.3.2 分批发酵培养基  23
      2.2.3.3 分批补料发酵培养基  23
    2.2.4 培养方法  23-24
      2.2.4.1 摇瓶发酵  23-24
      2.2.4.2 发酵罐分批发酵  24
      2.2.4.3 发酵罐分批补料发酵  24
    2.2.5 分析方法  24-26
      2.2.5.1 浊度法测定菌体浓度  24
      2.2.5.2 腈酶活力测定  24-25
      2.2.5.3 比色法测定发酵液中甘油含量  25
      2.2.5.4 蛋白质凝胶电泳  25-26
  2.3 结果与讨论  26-40
    2.3.1 摇瓶培养基优化  26-28
    2.3.2 诱导剂的选择  28-29
    2.3.3 IPTG诱导策略优化  29-30
    2.3.4 发酵pH优化  30-34
      2.3.4.1 初始pH对细胞生长及腈酶生产的影响  31-32
      2.3.4.2 恒定pH对细胞生长及腈酶生产的影响  32-34
    2.3.5 摇瓶培养温度优化  34-36
    2.3.6 最优条件下5 L发酵罐中的分批培养  36-37
    2.3.7 补料分批发酵  37-39
    2.3.8 在30 L发酵罐中的扩大培养  39-40
  2.4 本章小结  40-41
第3章重组大肠杆菌细胞的固定化及其催化制备(R)-(-)-扁桃酸的性质  41-52
  3.1 前言  41-42
  3.2 材料与方法  42-44
    3.2.1 试剂  42
    3.2.2 重组腈酶大肠杆菌的培养方法  42
    3.2.3 腈酶活力测定  42
    3.2.4 海藻酸钙凝胶包埋细胞  42-43
    3.2.5 聚乙烯亚胺与戊二醛交联固定化细胞  43
    3.2.6 腈酶的热稳定性试验  43
    3.2.7 生物转化扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸  43-44
  3.3 结果与讨论  44-51
    3.3.1 海藻酸钙凝胶包埋细胞  44-45
      3.3.1.1 细胞用量优化  44
      3.3.1.2 海藻酸钠浓度对固定化细胞的影响  44-45
    3.3.2 海藻酸钙凝胶包埋细胞的储存稳定性  45-46
    3.3.3 聚乙烯亚胺处理时间的优化  46-47
    3.3.4 游离细胞、凝胶包埋细胞及包埋-交联固定化细胞的热稳定性  47-48
    3.3.5 底物浓度对反应性能的影响  48-50
      3.3.5.1 底物浓度对反应初速度的影响  48-49
      3.3.5.2 底物浓度对反应进程的影响  49-50
    3.3.6 固定化细胞的操作稳定性  50-51
    3.3.7 (R)-(-)-扁桃酸的克级制备  51
  3.3. 本章小结  51-52
结论和展望  52-54
参考文献  54-60
附录  60-62
硕士在读期间撰写的论文  62-63
致谢  63

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