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辅酶Q_（10）高产菌株理性选育与发酵优化

作　者: 王娅
导　师: 郑毅
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 辅酶Q10 理性选育发酵优化发酵动力学模型补料发酵
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

从实验室保藏菌中筛选到一株辅酶Q10的产生菌XM023,产辅酶Q10达18.80mg/L。首先通过菌落形态与细胞镜检观察,以及液体培养与生理生化特征分析,初步判断该菌为革兰氏阴性菌,细胞富含色素,为典型的光合细菌。进一步采用16SrDNA分子鉴定技术,测定XM02316S rDNA序列,并构建了系统进化树,最终确定该菌为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。以XM023为出发菌株,采用紫外线和LiCl两轮诱变育种,筛选获得耐对羟基苯甲酸、罗红霉素的突变株XMⅡ136,其辅酶Q10产量为31.79mg/L,较出发菌株提高69.10%,突变株XMⅡ136经5次连续传代培养,辅酶Q10产量保持在29mg/L-33mg/L,结果表明XMⅡ136是一株性状较稳定、可深入开发研究的优良菌株。对XMⅡ136进行辅酶Q10发酵优化,首先通过单因素筛选确定了培养基最佳碳源为葡萄糖,氮源为玉米浆；最佳的发酵条件为：接种量10%,初始pH值6.8,装液量50mL/250mL三角瓶；接着通过二水平Plackett-Burman设计对培养基中的9种成分进行筛选,获得影响发酵的3个重要成分：葡萄糖、谷氨酸、NaCl;再利用响应面分析法对该3组份进行3水平的优化,获得它们的最佳组合：葡萄糖34.2mg/L、谷氨酸2.42mg/L、NaCl 1.98mg/L。通过以上优化过程,辅酶Q10最终发酵水平达到129.21mg/L,比优化前提高了306%。通过分析XMⅡ136辅酶Q10摇瓶发酵的代谢过程,结果表明辅酶Q10合成与菌体生长为半耦联过程。基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,构建辅酶Q10发酵菌体生长、底物消耗、产物生成的动力学数学模型,对该动力学模型进行实验拟合,求解相关动力学参数,最终获得动力学数学方程。该数学方程与实验数据能较好地吻合,较好地描述了XMⅡ136辅酶Q10摇瓶分批发酵过程。研究不同维生素对辅酶Q10合成的影响,结果表明：p-胡萝卜素效果最为明显,比对照提高了32.3%。VB1、氯化胆碱、生物素分别比对照提高了11.2%、13.3%、10.8%；同时,实验表明不同添加物的最适添加时间也不同：生物素、B1在发酵初期添加较好；而p-胡萝卜素、氯化胆碱在发酵过程中添加效果较好。此外,向培养基中添加豆油发现,豆油对辅酶Q10合成有促进作用,其产量与对照相比提高了7.6%。对辅酶Q10补料发酵进行研究,首先,在摇瓶条件下考察了葡萄糖补加时间、补加量和补加方式对辅酶Q10的影响,结果表明发酵36h补加糖液比发酵起始补糖效果要好,补加总糖量为30g/L,少量多次补加可获得最大辅酶Q10产量218.78mg/L。在此基础上,进行10L发酵罐分批发酵与补料发酵的放大实验,结果表明：对于辅酶Q10合成,补料发酵优于分批发酵,前者辅酶Q1o发酵水平可达704.9mg/L,比分批发酵(辅酶Q10发酵水平358.5 mg/L)提高了96.6%。

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