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不透明红球菌生物合成α-酮异己酸的研究

作　者: 祝玉洪
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: α-酮异己酸(KIC) 不透明红球菌(Rhodococcus opacus DSM 43250)发酵优化分批发酵生物转化
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

α-酮异己酸(KIC),是支链氨基酸-亮氨酸的中间代谢产物,在生物体内氨基酸的新陈代谢和氧化还原状态的维持过程中具有重要作用,同时也是有机合成、药物合成及生物合成的关键中间体。α-酮异己酸被广泛应用于生物医药、食品工业和动物饲料等领域。本论文以一株能合成L-氨基酸氧化酶的不透明红球菌(Rhodococcus opacus DSM43250)为研究菌株,以α-酮异己酸产量的提高为目标对发酵过程和转化过程进行了一系列的优化。主要研究结果如下：1、建立了高效液相色谱法测定转化液中α-酮异己酸含量的检测方法,考察了流动相浓度、甲醇浓度、柱温、pH和流动相流速对保留时间和峰面积的影响,确定高效液相色谱测定α-酮异己酸的最佳条件为：流动相为0.01 mol/L的磷酸氢二铵(pH2.50)和甲醇的混合溶液,其体积配比为90：10,流速0.8 mL/min,柱温35℃,进样量10μL；采用ZORBAX SB-Aq(4.6×250 mm,5μm)色谱柱,在波长203 nm条件下进行紫外检测。2、利用单因素实验和响应面法对不透明红球菌转化合成α-酮异己酸的培养基组分进行了优化,通过SAS软件回归分析建立二次多项式模型,确定最佳培养条件为：(NH4)2SO40.23g/L,麦芽膏2.42g/L,NaNO31.43gh/L。在此培养条件下α-酮异己酸的最高产量为23.93 mg/L。3、利用响应面法对不透明红球菌转化合成α-酮异己酸的培养条件进行了优化,通过SAS软件回归分析建立了二次多项式模型,确定最佳培养条件为：接种量6.93%,装液量33.38 mL,初始pH7.6。在优化后的培养条件下α-酮异己酸最高产量为30.97 mg/L。4、采用3L自动发酵罐,对不透明红球菌分批发酵中pH、搅拌速率和通气量对发酵的影响进行了研究。实验结果表明,分批发酵最佳的控制条件为：pH7.25,通气量1.0vvm,搅拌速率300 r/min。在最佳的控制条件下,分批发酵中α-酮异己酸的最高产量达到267 mg/L。5、利用单因素法确定了温度、pH、底物浓度、细胞浓度和转速的最佳范围,然后通过五因素五水平的中心组合实验对五种条件进行了进一步的优化,确定最佳条件为：温度43.66℃,pH8.38,底物浓度5.08g/L,细胞浓度30.41g/L,转速169.74 r/min。在优化的转化条件下,α-酮异己酸的最大产量为1264mg/L。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-16
  1.1 α-酮异己酸的性质  8-9
  1.2 α-酮异己酸的应用  9-10
    1.2.1 α-酮异己酸在医药领域的应用  9
    1.2.2 α-酮异己酸在食品领域的应用  9-10
    1.2.3 α-酮异己酸在饲料领域的应用  10
  1.3 α-酮异己酸合成方法的研究进展  10-12
    1.3.1 化学合成法  10-11
    1.3.2 发酵法  11
    1.3.3 酶法  11-12
    1.3.4 微生物转化法  12
  1.4 微生物转化  12-14
    1.4.1 微生物转化的特点  12-13
    1.4.2 微生物转化的类型  13-14
  1.5 本论文的选题依据和研究内容  14-16
第二章材料与方法  16-18
  2.1 菌种  16
  2.2 仪器  16
  2.3 培养基  16
  2.4 培养方法  16-17
  2.5 转化方法  17
  2.6 测定方法  17-18
第三章结果与讨论  18-46
  3.1 α-酮异己酸高效液相色谱检测方法的建立  18-20
    3.1.1 检测波长的确定  18
    3.1.2 色谱条件的选择  18-19
    3.1.3 标准曲线的建立  19-20
    3.1.4 检测方法的验证  20
  3.2 不透明红球菌转化合成α-酮异己酸发酵培养基组分的优化研究  20-26
    3.2.1 碳源对不透明红球菌发酵的影响  20
    3.2.2 氮源对不透明红球菌发酵的影响  20-21
    3.2.3 Plackett-Burman实验  21-22
    3.2.4 最陡爬坡实验  22
    3.2.5 响应面分析实验设计筛选重要因素的最优浓度水平  22-26
  3.3 不透明红球菌转化合成α-酮异己酸摇瓶发酵条件的优化研究  26-30
    3.3.1 Plackett-Burman实验  26-27
    3.3.2 最陡爬坡实验  27
    3.3.3 响应面分析实验设计筛选关键因素的最优水平  27-30
  3.4 不透明红球菌分批发酵的优化控制研究  30-38
    3.4.1 pH对不透明红球菌分批发酵的影响  30-33
    3.4.2 搅拌转速对不透明红球菌分批发酵的影响  33-36
    3.4.3 通气量对不透明红球菌分批发酵的影响  36-38
  3.5 不透明红球菌转化合成α-酮异己酸转化条件的优化研究  38-46
    3.5.1 温度对转化的影响  39
    3.5.2 pH对转化的影响  39-40
    3.5.3 底物浓度对转化的影响  40-41
    3.5.4 菌体浓度对转化的影响  41
    3.5.5 转速对转化的影响  41-42
    3.5.6 响应面分析实验设计确定最优转化条件  42-46
第四章结论与展望  46-48
  4.1 结论  46-47
  4.2 展望  47-48
致谢  48-50
参考文献  50-54
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  54

不透明红球菌生物合成α-酮异己酸的研究

内容摘要

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