学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Micro-Tom番茄高效遗传转化体系建立

作　者: 刘小花
导　师: 陈昆松；徐昌杰
学　校: 浙江大学
专　业: 果树学
关键词: Micro-Tom番茄再生遗传转化卡那霉素潮霉素抗性植株转基因检测荧光定量PCR
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 363次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

Micro-Tom是微型矮化的番茄品种。与普通番茄相比,它植株矮小、种植密度高、生命周期短并且可以被高效地转化。这些优点使得Micro-Tom在植物功能基因组学研究方面具有重要作用并被广泛应用。本研究以Micro-Tom为试材,建立了高效再生体系和遗传转化体系,获得了转基因植株,并应用实时PCR技术对转基因材料进行了分子鉴定。主要研究结果如下。（1）建立了Micro-Tom番茄高效再生体系研究不同外植体类型及切割方式、激素配比、糖浓度等因素对不定芽或根再生的影响,建立一套高效稳定的组织培养再生体系。结果表明:子叶再生不定芽频率高于下胚轴;子叶外植体在培养基中的切割方式以横切为佳;2.0mg·L^-1ZR和0.5mg·L^-1IAA组合最适合诱导高频率的Micro-Tom番茄愈伤组织和再生植株;培养基中蔗糖浓度为20g·L^-1时最有利于不定芽再生,0.2mg·L^-1IBA最适合诱导新生根。（2）建立了Micro-Tom番茄遗传转化体系建立了一套基于Kan筛选的遗传转化体系。将切好的子叶在已稀释至OD₆₀₀值为0.1的农杆菌菌液中浸泡10min,接种到不含抗生素的培养基中共培养2d;共培养后的外植体转移至Kan浓度为100mg·L^-1的培养基中筛选;最终转化率平均为11.25%。同时也对潮霉素抗性筛选体系进行了初步研究,表明10 mg·L^-1的潮霉素最适合用于筛选抗性芽。（3）建立了转基因检测体系以筛选标记基因NPTⅡ和植物内标基因CRTISO为检测对象,建立了转基因植物PCR检测体系。结果表明,所建立的PCR检测体系能有效地对抗性植株进行转基因检测。根据NPTⅡ和CRTISO基因实时PCR的Ct差值（△Ct）,应用2^1+△Ct可判断基因插入与否。确立了用于实时PCR检测的最佳模板浓度范围。用煮沸法制备的模板DNA用于PCR扩增时稀释100-10000倍为佳。经提取纯化的模板DNA浓度在0.25-25ng·μL^-1。为佳。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略词  9-10
目录  10-14
第1章文献综述  14-23
  1.农杆菌介导的番茄遗传转化研究进展  14-17
    1.1 农杆菌介导法的转化机理  14-15
    1.2 影响农杆菌介导番茄遗传转化因素  15-16
      1.2.1 植物基因型  15
      1.2.2 转化受体  15
      1.2.3 菌液浓度和侵染时间  15-16
      1.2.4 预培养  16
      1.2.5 抗生素  16
    1.3 转基因番茄研究进展  16-17
  2.Micro-Tom番茄的品种由来和生物学特征  17-18
    2.1 Micro-Tom番茄的品种由来  17
    2.2 生物学特征  17-18
  3.Micro-Tom番茄在功能基因组学研究中的应用  18-19
    3.1 适于功能基因组学研究的特征  18
    3.2 Micro-Tom番茄在基因和启动子功能鉴定中的应用  18-19
  4.Micro-Tom番茄在遗传转化体系优化的研究进展  19-20
    4.1 卡那霉素(Kan)体系  19
    4.2 潮霉素(Hyg)体系  19-20
    4.3 草甘膦体系  20
  5.转基因检测方法  20-21
  6.研究意义与内容  21-23
    6.1 研究意义  21
    6.2 研究内容  21-23
第2章 Micro-Tom番茄高频再生体系的建立  23-33
  1.材料与方法  23-25
    1.1 实验材料  23-24
    1.2 培养基组分  24
    1.3 不同浓度的生长素对Micro-Tom番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响  24
    1.4 不同外植体对Micro-Tom番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响  24
    1.5 外植体切割方式诱导不定芽再生的能力  24
    1.6 蔗糖浓度对Micro-Tom番茄子叶诱导不定芽再生的能力  24-25
    1.7 不定芽的生根培养与移栽  25
  2.结果与分析  25-31
    2.1 不同浓度的生长素对Micro-Tom番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响  25-27
    2.2 不同外植体对Micro-Tom番茄愈伤组织和不定芽诱导的影响  27-28
    2.3 外植体切割方式诱导不定芽再生的能力  28-29
    2.4 蔗糖浓度对Micro-Tom番茄子叶诱导不定芽再生的能力  29-30
    2.5 不定芽生根的诱导  30-31
  3.讨论  31-33
第3章 Micro-Tom番茄卡那霉素抗性的遗传转化体系  33-39
  1.材料与方法  33-34
    1.1 实验材料  33
    1.2 菌株和质粒  33
    1.3 培养基及无菌外植体的获取  33-34
    1.4 番茄子叶对Kan抗性实验  34
    1.5 转化和再生  34
      1.5.1 农杆菌的培养、活化  34
      1.5.2 外植体的浸染、共培养与筛选  34
  2.结果与分析  34-36
    2.1 Kan使用浓度对Micro-Tom番茄子叶不定芽再生的影响  34
    2.2 抗性芽的再生  34-35
    2.3 转化频率  35-36
  3.讨论  36-39
    3.1 褐变对转化的影响  36-37
    3.2 共培养对植物遗传转化的影响  37-38
    3.3 番茄遗传转化研究的外植体选择  38-39
第4章 Micro-Tom番茄潮霉素抗性体系初步建立的探讨  39-44
  1.材料与方法  39-40
    1.1 实验材料  39
    1.2 菌株和质粒  39-40
    1.3 培养基及无菌外植体的获取  40
    1.4 番茄子叶对Hyg抗性实验  40
    1.5 转化和再生  40
      1.5.1 农杆菌的培养、活化  40
      1.5.2 外植体的浸染、共培养与筛选  40
  2.结果与分析  40-43
    2.1 Micro-Tom番茄不定芽和愈伤组织对不同浓度的Hyg的抗性  40-41
    2.2 转基因Micro-Tom番茄最佳Hyg浓度的筛选  41-43
  3.讨论  43-44
第5章转基因番茄植株的检测  44-53
  1.材料与方法  44-46
    1.1 材料  44-45
      1.1.1 植物材料  44
      1.1.2 引物  44-45
      1.1.3 主要试剂  45
    1.2 方法  45-46
      1.2.1 模板DNA的制备  45
        1.2.1.1 煮沸方法制备模板DNA  45
        1.2.1.2 SDS提取法制备模板DNA  45
      1.2.2 不同提取法制备的模板进行PCR反应最佳模板浓度的确定  45
      1.2.3 普通PCR反应体系及程序  45-46
      1.2.4 荧光定量PCR反应体系及程序  46
  2.结果与分析  46-51
    2.1 不同提取法制备的模板进行PCR反应最佳模板浓度的确定  46-48
      2.1.1 煮沸方法制备模板DNA的最佳浓度  46-47
      2.1.2 SDS提取法制备模板DNA的最佳浓度  47-48
    2.2 普通PCR检测转基因番茄植株结果  48-49
    2.3 荧光定量PCR反应结果分析  49-51
  3.讨论  51-53
结语  53-54
参考文献  54-60
作者简历  60

Micro-Tom番茄高效遗传转化体系建立

内容摘要

全文目录

相似论文