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大豆组织培养体系的优化及EPSPS遗传转化的研究

作　者: 王婉婉
导　师: 王罡
学　校: 天津大学
专　业: 发酵工程
关键词: 大豆转基因 农杆菌 子叶节 草甘膦
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


通过基因工程的方法将抗除草剂基因转入到目前生产上正在应用的大豆品种中,可以为培育抗除草剂品种提供育种材料。成功的遗传转化依赖于良好的再生系统,目前,大豆的组织培养仍存在很多问题,本实验旨在完善大豆组织培养及转化体系,从而缓解大豆再生频率及遗传转化率低的难题,同时提高再生苗移栽的成活率。使用农杆菌介导的大豆子叶节转化方法,对受体大豆品种黑农37、北京小粒豆进行了遗传转化的研究,建立了较为完善的大豆遗传转化体系。实验中利用子叶节方法转化北京小粒豆,已得到抗性植株225棵,种子38粒。研究表明大豆种子利用氯气灭菌法灭菌,利用300mL的密封杯,每次20mL次氯酸钠加2mL浓盐酸,灭菌时间5h效果良好,既能保证灭菌效果,又不明显降低大豆发芽率。向发芽培养基中添加大约2mg/L的BAP可以提高遗传转化率。实验还得出最适宜的丛生芽诱导延迟培养天数为7天,可缓解丛生芽分化过多而很难伸长的问题。农杆菌介导的大豆子叶节法转基因,当采用草甘膦作为转化筛选剂时,对于大豆品种黑农37和北京小粒豆,在芽诱导筛选阶段合适的筛选浓度10~15mg/L,不应低于10mg/L。大豆的生根培养基一般都添加IBA,但生根培养基中的IBA会诱导幼苗基部愈伤组织的膨大,移栽后常常会因染菌而死亡。在切下幼芽之后基部蘸少许IBA溶液,一般幼苗都可顺利生根,提高了移栽成活率。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 引言  7-21
  1.1 研究的目的和意义  7-9
  1.2 除草剂草甘膦的作用机理  9-12
    1.2.1 草甘膦的性质及作用特点  9
    1.2.2 草甘膦的作用机理  9-10
    1.2.3 抗草甘膦作物基因工程  10-11
    1.2.4 抗草甘膦基因—EPSPS基因的获得  11-12
  1.3 大豆遗传转化方法  12-16
    1.3.1 农杆菌介导法  12-13
    1.3.2 基因枪法  13-14
    1.3.3 花粉管通道法  14-15
    1.3.4 电激和PEG/电激法  15
    1.3.5 显微注射法  15
    1.3.6 超声波辅助农杆菌介导法  15-16
  1.4 农杆菌介导法转化大豆再生体系的研究进展  16-18
    1.4.1 体细胞胚胎再生体系  16-17
    1.4.2 不定芽器官再生体系  17
    1.4.3 原生质体再生体系  17-18
  1.5 农杆菌介导大豆的遗传转化中的问题和解决办法  18-21
    1.5.1 农杆菌的侵染能力  18
    1.5.2 大豆的易感性  18-19
    1.5.3 抗氧化剂对大豆遗传转化的影响  19
    1.5.4 酚类化合物对转化的作用  19-20
    1.5.5 筛选剂对转化效率的影响  20-21
第二章 农杆菌介导的大豆子叶节法转基因  21-53
  2.1 材料与方法  21-33
    2.1.1 植物材料与农杆菌  21-22
    2.1.2 主要仪器与试剂  22
    2.1.3 质粒的提取与检测  22-25
    2.1.4 农杆菌介导的大豆子叶节转基因方法基本程序  25-28
      2.1.4.1 农杆菌培养基和保存培养方法  25
      2.1.4.2 大豆子叶节法组培及农杆菌转化用的基础培养基  25-27
      2.1.4.3 大豆子叶节法组培及农杆菌转化用的基础操作步骤  27-28
    2.1.5 大豆农杆菌转化系统的优化  28-31
    2.1.6 抗性植株的检测  31-33
  2.2 结果与分析  33-49
    2.2.1 质粒的检测  33
    2.2.2 种子灭菌时间的确定  33-34
    2.2.3 发芽培养基添加激素及浓度的确定  34-36
    2.2.4 最适转化苗龄的确定  36-37
    2.2.5 芽诱导阶段培养时间的确定  37-40
    2.2.6 草甘膦筛选压力的确定  40-42
    2.2.7 生根培养基的优化  42-44
    2.2.8 抗性植株的分子检测  44-46
    2.2.9 大豆农杆菌介导的子叶节转化系统优化后的方案  46-49
  2.3 讨论  49-53
    2.3.1 草甘膦作为大豆转基因筛选剂利弊  49
    2.3.2 大豆种子灭菌问题  49
    2.3.3 大豆种子发芽培养方面  49-50
    2.3.4 关于丛生芽诱导及伸长  50-51
    2.3.5 生根及移栽条件  51
    2.3.6 论农杆菌转化植物方法与纯合的健康转基因植株  51-53
结论  53-54
参考文献  54-58
发表论文和科研情况说明  58-59
致谢  59

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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