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渔用弧菌疫苗注射佐剂的筛选和口服微粒的研制

作　者: 李中权
导　师: 简纪常；吴灶和
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 弧菌铝胶佐剂白油佐剂口服疫苗海藻酸钠微球荧光示踪免疫组化
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文选用铝胶佐剂和白油佐剂为弧菌疫苗注射用佐剂,制备了两种佐剂苗和一种水剂苗腹腔注射免疫红笛鲷,用间接ELISA法测定血清抗体滴度,并对其免疫保护率进行了评价。结果表明,红笛鲷在免疫后都发生特异性免疫反应,所有免疫组与对照组间抗体效价都存在显著差异(P<0.01),铝胶组提升抗体效价比较快下降也比较快,白油佐剂组抗体提升后能够维持相对较长的一段时间。56天后各组分别用溶藻弧菌和哈氏弧菌攻毒,白油佐剂组免疫保护率为85.4%和82.6%,铝胶佐剂组为47.9%和41.3%,而水剂组为16.7%和21.7%。本文选用海藻酸钠作为口服投递载体,采用乳化复沉淀方法包裹哈维氏弧菌全菌制备成疫苗微球,并对微球的制备工艺进行了优化,结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,菌浓度4×109 CFU. mL-1,水油相比1:9(0.1%Span80乳化剂),转速2000 r/min为其最佳制备工艺,微球疫苗粒径为37.5±0.478μm,跨度0.46,微球包封率高达98.6%。微球在体外模拟胃液和肠液12h释放率分别为10.2%和9.3%,24h释放率分别为16.8%和13.2%。FITC标记的荧光微球示踪表明微球能通过消化道到达后肠,1-24h在后肠能够检测到荧光微球,并可以明显看到后肠对荧光微球的吸收。免疫组织化学结果显示后肠在灌胃1天后免疫组化能检测到棕黄色的阳性颗粒,只到第7天还能在后肠检测到。微球疫苗口服免疫红笛鲷后,用间接ELISA法测定血清、肠粘液和体表粘液抗体效价,结果表明,红笛鲷在免疫后都发生特异免疫反应,灌胃组和投喂组在第四周时血清抗体效价都达到峰值1:4096和1:2048;肠粘液抗体效价在第3周和第5周分别达到峰值1:1024和1:512;体表粘液抗体效价和对照组没有明显变化。免疫30天后用活菌攻毒,测定受免鱼的免疫保护率,口服微粒灌胃组和投喂组30天后的免疫保护率分别为63.1%和47.3%。综合以上结果表明海藻酸钠能作为弧菌口服疫苗的投递载体,微球疫苗具有较好的免疫效果。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
1. 前言  10-22
  1.1 鱼类疫苗的研究概况  10-16
    1.1.1 鱼类疫苗的种类  10-12
    1.1.2 鱼类佐剂的研究概况  12-14
    1.1.3 鱼类疫苗免疫方式  14-15
    1.1.4 弧菌疫苗的研究现状  15-16
  1.2 鱼类口服疫苗的研究现状  16-21
    1.2.1 口服疫苗的种类  16-17
    1.2.3 口服疫苗投递载体系统研究  17-18
    1.2.4 口服疫苗制备方法研究  18-19
    1.2.5 微球在胃肠道的摄取和转运  19
    1.2.6 口服粘膜免疫机理研究概况  19-20
    1.2.7 口服引起的免疫保护机理  20-21
  1.3 研究目的及意义  21-22
2. 红笛鲷弧菌疫苗注射用佐剂筛选  22-29
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 菌株  22
    2.1.2 红笛鲷  22
    2.1.3 主要试剂和溶液  22-23
    2.1.4 主要仪器  23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 溶藻弧菌、哈氏弧菌联合疫苗的制备  23
    2.2.2 铝胶佐剂疫苗配制  23
    2.2.3 白油佐剂疫苗配制  23-24
    2.2.4 疫苗的安全性  24
    2.2.5 疫苗免疫效果评价  24-25
  2.3 结果  25-27
    2.3.1 疫苗安全性和物理性状  25
    2.3.2 红笛鲷血清抗体效价  25-26
    2.3.3 免疫保护率  26-27
  2.4 讨论  27-29
3. 红笛鲷哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)全菌微球疫苗研究  29-52
  3.1 材料  29-31
    3.1.1 菌株  29
    3.1.2 红笛鲷  29
    3.1.3 主要试剂  29-30
    3.1.4 免疫组化试剂  30
    3.1.5 ELISA 试剂  30
    3.1.6 主要仪器  30-31
  3.2 方法  31-35
    3.2.1 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活菌体制备  31
    3.2.2 微球的制备工艺的优化  31-33
    3.2.3 微球形态和粒径的测定  33
    3.2.4 微球包封率的测定  33
    3.2.5 微球体外释放试验  33
    3.2.6 微球的荧光示踪  33-34
    3.2.7 后肠组织的免疫组化  34
    3.2.8 微球免疫效果的评价  34-35
    3.2.9 数据分析  35
  3.3 结果  35-49
    3.3.1 海藻酸钠浓度筛选结果  35-36
    3.3.2 转速的筛选结果  36-37
    3.3.3 水油相比列筛选结果  37-38
    3.3.4 微球包封率和菌浓度筛选结果  38-39
    3.3.5 微球体外释放  39
    3.3.6 红笛鲷血清抗体效价变化  39-40
    3.3.7 红笛鲷肠粘液抗体效价变化  40-41
    3.3.8 红笛鲷体表粘液抗体效价变化  41-42
    3.3.9 微球荧光示踪  42-46
    3.3.10 后肠组织的免疫组化  46-48
    3.3.11 微球的免疫保护率  48-49
  3.4 讨论  49-52
全文总结  52-53
参考文献  53-61
致谢  61-62
导师介绍  62-63
作者简介  63

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