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霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性相关基因的筛选及LysR和MFS蛋白功能的研究

作　者: 王玉文
导　师: 朱军
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 霍乱弧菌 群体感应 VqmA 多重药物转运蛋白 LysR
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


霍乱弧菌(V. cholerae)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧小杆菌,是引起人类腹泻疾病霍乱的病原体。大量研究证明,霍乱弧菌的致病能力主要是由霍乱毒素(cholerae toxin, CT)和毒素共调节菌毛(toxin-coregulated pilus, TCP)引起的。霍乱弧菌毒力基因的表达受到各种环境条件的影响,如营养物浓度和种类、温度、pH、胆汁盐和群体感应信号分子。HapR是霍乱弧菌群体感应调控系统的关键调控因子,可以抑制霍乱弧菌CT和TCP表达。LuxR家族蛋白VqmA可以在低细胞浓度时诱导HapR的表达从而降低细菌的致病性。本文通过构建转座子随机突变文库的方法筛选影响VqmA活性的基因,获得七株候选的突变株,并且对突变株M1(△VC0073, SAM-依赖的甲基转移酶)做了深入的研究。研究发现该基因缺失后,VqmA无法激活报告基因的表达,并且VqmA的转录调控活性随着该基因的回复表达而恢复,VC0073是VqmA发挥活性的必须基因。VC0073编码合成的蛋白与SAM-依赖的甲基转移酶的同源性最高,在很多细菌中该酶参与一些小分子化合物的合成,VqmA激活目的基因的过程可能需要该酶合成的某类化合物的协助,但是研究发现该化合物并不存在于细菌上清液中。LysR类蛋白是一种全局性的转录调控因子,霍乱弧菌中约有40个LysR类型的蛋白。借助生物信息学工具,在霍乱弧菌中发现了五类比较特殊的LysR蛋白,这些蛋白的下游都为MFS家族蛋白。MFS家族蛋白属于多重药物转运蛋白。我们选取其中一组基因VC1617 (Encoding LysR Protein)和VC1618 (Encoding Multidrug Resistance protein)作为研究对象,研究发现VC1617缺失和过表达后霍乱弧菌可以在LB和M9培养基正常生长,VC1617并不是细菌在这两中培养基生长的必需基因,这在一定程度上也反映出了LysR蛋白生理功能的多样性。通过构建Luminescence检测质粒发现LysR不但可以抑制自身的表达而且还可以激活下游基因VC1618 (Multidrug Resistance Gene)的表达。Western blot试验表明VC1617缺失后霍乱弧菌毒力基因的表达并没有受到影响；虽然VC1 617缺失后多重药物转运蛋白VC1618的表达量大为降低,但是突变株对一些特定药物的耐受能力并没有削弱；在毒力基因的表达量和药物的耐受能力都没有降低的情况下,突变株在小鼠体内的定殖能力也没有降低。

全文目录


摘要  5-6ABSTRACT  6-8文献综述  8-34  1 霍乱弧菌的治病机理  9-16  2 霍乱弧菌的群体感应  16-22  3 LysR家族蛋白和多重抗药性蛋白  22-30  参考文献  30-34第一章 影响霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性的相关基因研究  34-55  第一节 霍乱弧菌群体感应调控因子VqmA活性相关基因的筛选及鉴定  35-42    1 材料与方法  35-38    2 结果和分析  38-40    3 小结和讨论  40-42  第二节 VC0073对群体感应调控因子VqmA活性的影响  42-53    1 材料和方法  42-47    2 结果和分析  47-53    3 小结和讨论  53  本章小结  53-54  参考文献  54-55第二章 LysR和MFS蛋白功能的研究  55-70  第一节 LysR和MFS蛋白之间调控方式的研究  56-63    1 材料与方法  56-59    2 结果和分析  59-62    3 小结和讨论  62-63  第二节 LysR缺失菌株生理功能的研究  63-68    1 材料与方法  63-65    2 结果和分析  65-67    3 小结和讨论  67-68  本章小结  68-69  参考文献  69-70全文总结  70-72附录  72-74致谢  74

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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