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碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧大鼠心肌细胞蛋白激酶Cε、α转位及内钙变化的影响
作 者: 蔡文锋
导 师: 石刚刚
学 校: 汕头大学
专 业: 药理学
关键词: 碘化N-正丁基氟哌啶醇 心肌细胞 心肌微血管内皮细胞 钙超载 蛋白激酶Cε 蛋白激酶Cα 转位 缺血再灌注 缺氧复氧 线粒体
分类号: R965
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
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蛋白激酶C（protein kinase c,PKC）是广泛分布于真核细胞特别是哺乳类动物细胞中的一种蛋白激酶,属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一,是继于细胞外信号传递引起细胞内第二信使发生变化后重要的信号转导分子。PKC的活动依赖于磷脂,既参与了细胞增殖、分化、凋亡、基因表达、离子通道的调节、细胞分泌、膜转运和信号转导等一系列与生理现象相关的过程。作为经典的胞内递质分子,其活性的异常又与癌症发生、炎症、病毒感染、免疫和中枢神经系统紊乱、心血管异常、糖尿病并发心血管疾病以及胰岛素耐受等病理过程密切相关。静息状态下,PKC主要以无活性形式存于胞浆中,当细胞受到刺激后,PKC从胞浆移位到细胞膜或其他膜性成分上,此过程称为转位（translocation）,一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。前期研究表明碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-buytl haloperidol liodide,F2）通过抑制心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤时的早期生长反应基因-1（early growth response gene 1,Egr-1）高表达而保护心肌细胞,PKC作为Egr-1上游的调控因子之一,它是否参与了F2的细胞保护作用尚不清楚。我们选用原代培养心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,观察F2对心肌细胞H/R所致PKCε、α转位的影响。采用间接免疫荧光标记（indirect immunofluorescence staining）技术,借助激光共聚焦显微镜,以图像的形式阐明PKCε、α是否介导了F2的心肌保护作用。Hempel发现另一钙拮抗剂硝苯地平（nifedipine,NIF）不依赖于钙通道防止缺血引起的内皮细胞通透性增加。我们前期实验也表明F2能降低心肌微血管内皮细胞（以下简称内皮细胞）H/R损伤。由于部分内皮细胞缺乏L-型钙通道,为了探讨F2抑制细胞H/R损伤是否存在非钙依赖机制,我们在无细胞外钙的条件下建立心肌细胞H/R损伤模型,观察H/R诱导细胞内钙的变化以及F2对这种变化的影响,并通过高钾刺激的方法验证内皮细胞是否存在L-型钙离子通道。方法第一部分1.将原代培养的SD大鼠心肌细胞接种于预先放置在24孔板的盖玻片上,制成心肌细胞爬片（以下简称细胞爬片）,倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态及其搏动情况。2. H/R损伤模型建立细胞爬片换用被高纯氮气饱和的缺氧液,置于密闭箱中,37℃缺氧2h,然后换正常培养基在正常培养条件下培养0.5h,造成H/R损伤。3.实验分组取培养3-4d的细胞爬片随机分组:对照组（Control）、H/R、F2+H/R、佛波脂组（PMA）。PMA组先用线粒体探针MitoTracker@Deep Red FM（以下简称MitoTracker）标记线粒体,再用1mmol/L的PMA刺激心肌细胞5min。F2+H/R组在建立H/R损伤模型前先给予F2(1×10-5mol/L)在正常培养基条件培养30min,造模时缺氧液和复氧液均给予F2(1×10-5mol/L );Control组、H/R组和F2+H/R组在复氧时用含有MitoTracker的培养基进行复氧,同时标记线粒体。4.间接免疫荧光标记法标记不同组别细胞中的PKCε、α,并用激光共聚焦显微镜观察PKCε、α在心肌细胞中的分布情况。第二部分1.将原代培养的SD大鼠心肌细胞或内皮细胞接种于petri皿中,倒置相差显微镜下观察细胞形态。2.无钙条件下H/R损伤模型的建立用被高纯氮气饱和的无钙缺氧液灌流细胞2h,然后换通氧无钙Esumi缓冲液灌流48min,造成H/R损伤。3.实验分组培养3-4d的心肌细胞随机分组: H/R、F2+H/R。H/R组先用通氧无钙Esumi缓冲液灌流40min后作H/R模型;F2+H/R组用无钙Esumi缓冲液灌流10min,再换含F(21×10-5mol/L)无钙Esumi缓冲液灌流30min后作H/R模型,造模时无钙缺氧液、Esumi缓冲液均含F2(1×10-5mol/L)。4.高钾刺激细胞取培养在3-4d心肌细胞或内皮细胞,用终浓度为60mmol/L的KCl溶液刺激细胞。高钾刺激心肌细胞后用1×10-5mol/L维拉帕米作用细胞。5.高速钙离子成像系统记录各组细胞内钙浓度的变化情况。结果第一部分1.原代心肌细胞培养培养第3-4d心肌细胞在盖玻片上逐渐铺展,呈不规则多边形,具3-6个伪足;部分细胞聚集成簇,伪足相互接触交织成网,细胞搏动同步化。2. PKCε分布Control组PKCε散在分布于细胞胞浆中,部分与线粒体共定位,细胞膜未见PKCε;H/R组PKCε呈点状分布,与Control组相比,同线粒体共定位PKCε明显增多,细胞膜未见PKCε;F2+H/R组PKCε呈点状分布,与Control组相比,同线粒体共定位PKCε明显增多,细胞膜未见PKCε;H/R组和F2+H/R组PKCε分布无明显差异;与Control组比较,PMA组胞浆PKCε减少,部分与线粒体共定位,细胞膜上PKCε明显增多。3. PKCα分布Control组PKCα散在分布于细胞胞浆中,部分与线粒体共定位,细胞膜未见PKCα;H/R组PKCα呈点状分布,与Control组相比,同线粒体共定位PKCα明显增多,细胞膜未见PKCα;F2+H/R组PKCα呈点状分布,与Control组相比,同线粒体共定位PKCα明显增多,细胞膜未见PKCα;H/R组和F2+H/R组PKCα分布无明显差异;与Control组比较,PMA组胞浆PKCα减少,部分与线粒体共定位,细胞膜上PKCα明显增多。第二部分1.内皮细胞培养培养1-3h可见内皮细胞呈梭形,6h内皮细胞呈梭形或多角形,3-5d内皮细胞呈鹅卵石样排列,无重叠。2.无外钙条件下F2对H/R心肌细胞内钙的变化的影响H/R组缺氧时,细胞内钙明显增加,并稳定在一定水平。复氧后细胞内钙逐渐恢复到正常水平;F2+H/R组缺氧时,细胞内钙明显增加,并稳定在一定水平。复氧后细胞内钙逐渐恢复到正常水平;与H/R组比较,F2+H/R组缺氧或复氧时的内钙差异无统计学意义。3.高钾刺激对细胞内钙的影响KCl刺激内皮细胞后,内皮细胞内钙短暂下降后逐渐恢复到刺激前水平;KCl刺激心肌细胞后,心肌细胞内钙快速上升并维持在一定高位,用VER作用后,内钙逐渐回落到静息状态水平。结论1. H/R使PKCε、PKCα从胞浆转位到线粒体上。2. F2对H/R导致的PKCε、PKCα转位无影响。3.无细胞外钙条件下,F2对H/R导致的心肌细胞内钙上升无影响。4.心肌微血管内皮细胞无L-型钙通道。
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全文目录
中文摘要 4-8
英文摘要 8-13
缩略词表 13-16
前言 16-20
第一部分 碘化 N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧大鼠心肌细胞蛋白激酶 Cε、α 转位的影响 20-33
材料和方法 20-25
结果 25-30
讨论 30-32
结论 32-33
第二部分 碘化 N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧心肌细胞内钙变化的 影响 33-47
材料和方法 33-38
结果 38-44
讨论 44-46
结论 46-47
参考文献 47-52
文献综述 52-61
参考文献 58-61
个人简介 61-62
致谢 62
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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