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隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎小鼠模型肠道组织中的动态表达规律研究

作　者: 孙哲
导　师: 梁宏德；杨玉荣
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 溃疡性结肠炎 BALB/c小鼠隐窝素-1 隐窝素-4 荧光定量PCR 相对表达量
分类号: S858.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为了研究隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎发病过程中的作用及作用机制,本研究以BALB/c小鼠为研究对象,自由饮用7%的葡聚糖硫酸钠溶液7 d制造UC急性模型,分别在用药1 d,3 d,5 d,7 d时,采取小鼠十二指肠,空肠,回肠和结肠,应用实时荧光定量PCR的方法检测小鼠肠道中cryptdin-1与cryptdin-4的动态表达规律及相关性。主要结果如下:1.小鼠急性UC模型不同时期肠道同一部位cryptdin-1 mRNA的动态表达变化:小肠中,cryptdin-1 mRNA在1 d时表达量最高,且极显著高于其他3个时期(P<0.01);5 d的表达量次之且与3 d表达水平有差异显著性(P<0.05);7 d时表达量最低,且极显著低于前3个时期(P<0.01)。结肠中,在1 d时表达水平最高,也极显著高于其他3个时期(P<0.01);7 d的表达量次之;5 d的相对表达量最低。2.小鼠急性UC模型同一时期肠道不同部位cryptdin-1 mRNA表达量的动态变化:炎症1 d时,cryptdin-1 mRNA在十二指肠表达最高,显著高于其他三个肠段(P<0.05);空肠次之;结肠中最低且与其他三肠段的呈极显著差异性(P<0.01)。炎症3 d和5 d时,十二指肠最高,回肠次之,也是在结肠中最低且极显著低于十二指肠、空肠、回肠的表达水平(P<0.01)。炎症7 d时的表达量是空肠中最高,回肠次之,结肠最低,三个部位之间的差异均极显著(P<0.01)。3.小鼠急性UC模型不同时期肠道同一部位cryptdin-4 mRNA的动态表达变化:十二指肠和空肠是在炎症1 d时达到最高表达量水平且极显著高于3 d,7 d的水平(P<0.01);5d的表达水平次之;在7 d时表达量降至最低。回肠中,cryptdin-4 mRNA在5 d时最高且显著高于其他三个时期(P<0.05);1 d时次之与3 d、7 d相比均达到极显著水平(P<0.01);也是7d时最低水平。结肠中,cryptdin-4 mRNA在7 d时表达水平最高,且与其他三个时期差异都极显著(P<0.01);1 d时次之;3 d时表达水平最低。4.小鼠急性UC模型同一时期肠道不同部位cryptdin-4 mRNA表达量的动态变化:炎症1 d和3 d时,cryptdin-4 mRNA在十二指肠最高且与结肠的差异极显著(P<0.01);空肠次之且与结肠的表达水平差异显著(P<0.05);结肠中最少。5 d时,十二指肠最高且与其他部位都差异极显著(P<0.01);回肠次之且与结肠的差异显著(P<0.05);也是在结肠中最低。炎症7 d时,结肠中最高且极显著高于十二指肠的水平(P<0.01);空肠次之;十二指肠最低且与三个部位之间的差异均极显著(P<0.01)。5.小鼠急性UC模型中cryptdin-1与cryptdin-4相对表达量的相关性:cryptdin-1和cryptdin -4 mRNA表达在小鼠急性UC模型炎症过程中呈极显著正相关(r=0.801,P<0.01)。这些结果提示,在cryptdin-1与cryptdin-4在UC炎症的整个过程都有表达,其表达水平呈动态变化规律且有极显著相关性。在UC炎症的过程中,cryptdin-1与cryptdin-4在十二指肠和空肠中的表达水平都是在1 d时表达量最高,然后3 d时下降,5 d时又有回升,到7 d时降低到最低水平。cryptdin-1在回肠中的表达规律与十二指肠一样,而cryptdin-4是在5 d时处于最高水平。对于结肠段,cryptdin-1与cryptdin-4虽然都有表达,但整体的表达水平均较低,cryptdin-1是1 d时表达量最高而cryptdin-4是7 d时最高。说明cryptdin-1与cryptdin-4参与UC模型炎症的整个过程,且与UC的发生发展存在密切的关系,扮演着重要作用。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-9
1 文献综述  9-26
  1.1 防御素研究概况  9-16
    1.1.1 防御素的结构特征  9-10
    1.1.2 防御素功能的影响因素  10-12
    1.1.3 防御素的生物学活性  12-13
    1.1.4 防御素的应用前景  13-14
    1.1.5 防御素的基因工程研究  14-15
    1.1.6 小鼠潘氏细胞防御素概述  15-16
  1.2 溃疡性结肠炎研究进展  16-23
    1.2.1 UC 的发病机制  16-18
    1.2.2 UC 的临床和病理表现  18-19
    1.2.3 UC 的治疗  19-20
    1.2.4 UC 动物模型研究进展  20-22
    1.2.5 UC 与防御素  22-23
  1.3 实时荧光定量PCR 研究进展  23-26
    1.3.1 RealTimePCR 的原理  23
    1.3.2 RealTimePCR 的检测方法  23-24
    1.3.3 Real Time PCR的定量方法  24-26
2 引言  26-27
3 材料与方法  27-34
  3.1 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 的克隆及序列鉴定  27-31
    3.1.1 试验动物  27
    3.1.2 样品采集  27
    3.1.3 主要仪器设备  27
    3.1.4 主要试剂溶液及配制方法  27-28
    3.1.5 PCR 引物的设计与合成  28
    3.1.6 样品总RNA 的提取及检测  28
    3.1.7 RT 与PCR 扩增反应  28-30
    3.1.8 PCR 产物的回收与纯化  30
    3.1.9 回收 PCR产物的连接转化  30
    3.1.10 阳性转化子的筛选与菌液PCR鉴定  30-31
    3.1.11 目的基因序列鉴定  31
  3.2 cryptdin-1 与cryptdin-4 在DSS-UC 模型小鼠的肠道组织中的表达  31-34
    3.2.1 试验动物分组  31
    3.2.2 样品采集  31
    3.2.3 主要仪器设备  31
    3.2.4 主要试剂及配制方法  31-32
    3.2.5 DSS-UC 模型的建立与鉴定  32
    3.2.6 UC 模型小鼠不同时期相关肠段组织mRNA 变化规律检测  32-33
    3.2.7 数据统计方法  33-34
4 结果与分析  34-47
  4.1 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 的克隆及序列鉴定  34-36
    4.1.1 总RNA 的提取  34
    4.1.2 cryptdin-1与cryptdin-4 RT-PCR电泳结果  34
    4.1.3 菌液鉴定阳性克隆  34-35
    4.1.4 克隆片段的序列测定及分析  35-36
  4.2 cryptdin-1 与cryptdin-4 在UC 模型中小鼠肠道组织中的表达  36-47
    4.2.1 DSS-UC 肠炎模型的建立  36-37
    4.2.2 DSS-UC肠炎模型不同时期cryptdin-1 与cryptdin-4 mRNA表达水平检测  37-47
5 讨论  47-51
  5.1 小鼠肠道组织总 RNA的提取  47
  5.2 PCR 反应条件的优化  47
  5.3 小鼠cryptdin-1 与cryptdin-4 序列的克隆与分析  47-48
  5.4 UC 模型的建立  48-49
  5.5 cryptdin-1与cryptdin-4在UC模型小鼠的相关肠段组织中的表达变化规律  49-51
6 结论  51-52
7 不足与展望  52-53
参考文献  53-63
英文摘要  63-64

隐窝素-1与隐窝素-4在溃疡性结肠炎小鼠模型肠道组织中的动态表达规律研究

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