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罗非鱼海豚链球菌疫苗研制及胞外产物特性分析

作　者: 张旭丽
导　师: 吴灶和；简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 海豚链球菌(Streptococccus iniae) 鉴定胞外产物致病性疫苗免疫保护
分类号: S948
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

海豚链球菌（Streptococcus iniae）病是水生动物的一种重要细菌性疾病,可感染多种海水和淡水鱼类,在世界许多国家均有该病的暴发和流行,对水产养殖业造成了巨大危害。近年来我国海豚链球菌病也频频爆发,目前已经感染了牙鲆、罗非鱼、美国红鱼等。本实验从患病的罗非鱼体内经分离纯化得到一菌株,通过Biolog以及16SrRNA基因PCR鉴定该菌为海豚链球菌,并对罗非鱼进行了致病性实验,得出海豚链球菌对罗非鱼的半致死量为6.81×10⁷cfu/mL。药敏试验结果显示该菌对四环素、青霉素G、环丙沙星、新生霉素、头孢呋肟、呋喃妥因、氧哌嗪青霉素、强力霉素等较为敏感,而对新霉素、卡那霉素不敏感。由于该菌对培养基营养要求极高,同时为以后疫苗基础作准备,本实验对海豚链球菌的培养进行了优化研究,主要优化了液体培养基BHI的条件,得出海豚链球菌的培养基最适pH为7 8,最适培养温度为30℃,振荡培养对海豚链球菌的生长影响不明显。培养基优化研究表明,在BHI培养基中添加10 mg/mL的酵母粉和2 mg/mL的葡萄糖即可在对数期获得最大细菌量。同时也得出海豚链球菌的生长曲线,即:0 4 h为生长延迟期,4 24h为对数生长期,24 48 h为稳定期,随后进入衰亡期。通过琼脂平板扩散法、酪蛋白底物法研究了海豚链球菌胞外产物（ECP）的一些理化特性以及化学试剂对胞外产物酶（ECPase）的影响,将海豚链球菌ECP注射到罗非鱼体中检验其致病性,通过一维和双向电泳技术分析胞外产物蛋白点,并自制了鼠抗海豚链球菌用其对海豚链球菌胞外产物的免疫原性进行分析,结果显示海豚链球菌ECP具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶、明胶酶、脂肪酶以及溶血的活性,但不具有脲酶活性。EDTA、DTT、PMSF可以使ECPase的活性下降至72.4%、77.6%、72.4%,而Cu²⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺对ECPase的活性有抑制作用, Co²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺对其有一定程度的激活作用;ECPase对热稳定性较好,碱性条件下活性较高,其最适温度为55℃。经腹腔注射感染罗非鱼,发现对罗非鱼有致病性,且随ECP浓度的升高罗非鱼的死亡率也升高。在SDS-PAGE图中可发现ECP主要有12条条带,主要集中在28-68kDa之间,在双向电泳图中,海豚链球菌的ECP主要条带集中在26-95kDa之间,海豚链球菌在pH为4-7时有120个点。western-blot结果主要得出4条免疫条带,分子量分别为26kDa、37 kDa、95 kDa、97 kDa。同时研制了海豚链球菌福尔马林灭活疫苗以及白油佐剂疫苗,并用这两种疫苗分别腹腔注射罗非鱼（80g-100g）,每尾注射0.2mL,对照组注射无菌生理盐水,结果显示各免疫组对罗非鱼的溶菌酶活性、SOD活力、血清抗菌活力以及血清抗体效价水平均显著高于对照组。免疫八周后腹腔注射海豚链球菌菌液2×10⁸cfu/ml的剂量,观察15天后得出水剂组的相对保护率为65.43%,而油剂组的相对保护率为88.89%,表明这两种疫苗均有助于罗非鱼抵抗海豚链球菌的能力。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
1 前言  13-21
  1.1 鱼类链球菌病概述  13-15
    1.1.1 鱼类链球菌病主要病原  13
    1.1.2 链球菌危害的主要鱼类  13
    1.1.3 链球菌引起的病理现象  13
    1.1.4 鱼类链球菌病的流行病学  13-14
    1.1.5 预防与治疗  14-15
  1.2 海豚链球菌研究进展  15-20
    1.2.1 分类及生化性质  15
    1.2.2 分子生物鉴定  15-16
    1.2.3 病理学  16
    1.2.4 致病机理  16-19
    1.2.5 预防与治疗  19-20
  1.3 研究目的及意义  20-21
2 罗非鱼病原菌的分离、纯化及致病性分析  21-28
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 主要仪器和设备  21
    2.1.2 主要试剂  21
    2.1.3 溶液配制  21
    2.1.4 实验用鱼  21-22
  2.2 实验方法  22-24
    2.2.1 菌株分离以及扩大培养  22
    2.2.2 Biolog 鉴定系统的鉴定  22-23
    2.2.3 细菌分子鉴定  23-24
    2.2.4 分离菌对罗非鱼的致病性分析  24
    2.2.5 药物敏感性试验  24
  2.3 结果与分析  24-26
    2.3.1 患病鱼细菌的分离  24
    2.3.2 病原菌的Biolog 鉴定结果  24-25
    2.3.3 PCR 鉴定结果  25
    2.3.4 致病性实验结果  25
    2.3.5 药敏试验结果  25-26
  2.4 讨论  26-28
3 海豚链球菌培养的优化研究  28-36
  3.1 材料与方法  28-29
    3.1.1 适宜液体培养基的选择  28
    3.1.2 菌体浓度测定  28
    3.1.3 影响因素的优化  28-29
  3.2 结果  29-34
    3.2.1 适宜液体培养基结果  29
    3.2.2 适宜温度结果  29
    3.2.3 适宜pH 的结果  29-30
    3.2.4 溶氧对该菌生长的影响  30
    3.2.5 酵母粉的影响  30-31
    3.2.6 葡萄糖的影响  31
    3.2.7 培养基优化的正交试验  31-32
    3.2.8 采用优化条件培养的海豚链球菌生长曲线  32-34
  3.3 讨论  34-36
    3.3.1 海豚链球菌培养基的优化  34
    3.3.2 海豚链球菌培养条件的优化  34-35
    3.3.3 海豚链球菌在的生长动态  35-36
4 海豚链球菌胞外产物的理化特性及免疫原性分析  36-47
  4.1 材料  36-37
    4.1.1 菌株  36
    4.1.2 实验动物  36
    4.1.3 主要试剂与溶液  36-37
  4.2 方法  37-40
    4.2.1 胞外产物的制备  37
    4.2.2 海豚链球菌ECP 酶活性定性分析  37
    4.2.3 溶血性测定  37-38
    4.2.4 酪蛋白底物法分析ECPase  38
    4.2.5 SDS-PAGE 分析ECP  38
    4.2.6 双向电泳分析ECP  38-39
    4.2.7 胞外产物对罗非鱼的毒性作用  39
    4.2.8 胞外产物的免疫原性分析  39-40
    4.2.9 western-blot  40
  4.3 结果与分析  40-44
    4.3.1 海豚链球菌ECP 生物活性分析  40-43
    4.3.2 ECP 的SDS-PAGE 和双向电泳结果  43
    4.3.3 ECP 的 Western-blot 结果  43-44
    4.3.4 胞外产物对罗非鱼的毒性  44
  4.4 讨论  44-47
    4.4.1 胞外产物的致病性  45
    4.4.2 环境条件对ECPase 的影响  45
    4.4.3 胞外产物的蛋白条带及免疫原性  45-47
5 海豚链球菌疫苗对罗非鱼免疫功能的影响  47-56
  5.1 材料  47-48
    5.1.1 实验用鱼  47
    5.1.2 主要试剂  47
    5.1.3 溶液配制  47-48
  5.2 方法  48-51
    5.2.1 海豚链球菌的扩大培养  48
    5.2.2 菌株的灭活  48
    5.2.3 疫苗制备  48-49
    5.2.4 疫苗接种  49
    5.2.5 试验鱼的采血及血清处理  49
    5.2.6 疫苗对罗非鱼免疫效果  49-51
    5.2.7 攻毒试验  51
    5.2.8 统计学处理  51
  5.3 结果与分析  51-54
    5.3.1 灭活条件结果  51
    5.3.2 疫苗安全性评估  51
    5.3.3 疫苗对罗非鱼的免疫效果  51-53
    5.3.4 攻毒试验及免疫保护率结果  53-54
  5.4 讨论  54-56
    5.4.1 疫苗免疫对罗非鱼体液免疫功能的影响  54
    5.4.2 疫苗对罗非鱼非特异免疫功能的影响  54-55
    5.4.3 疫苗的免疫保护效果  55-56
总结  56-57
参考文献  57-64
致谢  64-65
作者简介  65-66
导师简介  66

罗非鱼海豚链球菌疫苗研制及胞外产物特性分析

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