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嗜水气单胞菌外膜提取物及胞外产物特性的分析

作　者: 沈锦玉
导　师: 余旭平
学　校: 浙江大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 嗜水气单胞菌胞外产物（ECP）细菌外膜提取物 SDS-PAGE 免疫转印染色
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

对六株嗜水气单胞菌(二株分离自中国鲤科鱼类、二株分离自中国的中华绒螯蟹、一株来自孟加拉国的鱼类、一株来自英国国家工业与海洋菌种收集中心(NCBIM)虹鳟鱼的标准菌株)的全细胞、外膜提取物和胞外产物(ECP)在不同的培养条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫转印(Western blotting)分析。所用培养基共五种，分别为：(1)胰胨大豆胨肉汤(TSB)；(2)缺铁TSB；(3)补铁TSB；(4)加鱼血清TSB；(5)英国水产疫苗公司提供的AVL培养基。结果发现：全细胞蛋白质电泳图谱：6株菌株在同一培养条件下全细胞的蛋白质电泳图谱是不一样的，同一菌株在五种不同的培养条件下，其蛋白质电泳图谱相似但不完全一致。盐酸胍细菌外膜提取物的图谱特征：6株菌株在同一培养条件下的盐酸胍细菌外膜提取物的蛋白质电泳图谱是不一样的，同一菌株在五种不同的培养条件下，其蛋白质电泳图谱相似但不完全一样。但所有的图谱具有相同分子量的条带，分别为34kDa和30kDa。用Schiff’s试剂，银染及凝集素标记(BS-1,ConA,UEA-1)法测定及分析提取物中碳水化合物的特征，发现凝集素标记及经蛋白酶k处理后的所有菌株的提取物均含有不同分子量碳水化合物的条带，但具有相同分子量的条带，其中32kDa条带被三种凝集素及银染所显示，而34kDa条带仅被BS-1和UEA-1所识别。而经Schiff’s试剂染色后，仅出现少量的条带。胞外产物(ECP)的特性分析：ECP的蛋白质电泳图谱显示，所有菌株具有不同的蛋白质图谱，但具有35kDa相同分子量的条带，而相同的菌株在 0不同的培养条什下具相似的图谱。不同的菌株在不同的培养条件下上清液中蛋白质含量是不一样的，每毫升上清液中蛋白质含量为l听mg。用底物惭叼匕泳沦测定了＊＊P的蛋白酶活性，所川的底物为u胶酪蛋白。商品的牛血红蛋白及新鲜的鱼血红蛋白。所有菌株的＊＊P在明胶和酪蛋臼底物电泳凝胶上具有清晰的条带，而在血红蛋白凝胶上仅出现少量条卅。经银染测定及分析＊＊P中碳水化合物的特征，发现经蛋白酶k处理后所有菌株的ECP均有不同分子量碳水化合物的条带，但具有相同分子量 3 5 kDa条带。经 Schiff’s试剂染色，在 ECP凝胶上没有显示任何条带。细菌外膜提取物与胞外产物的免疫原性：用免疫转印法（Western blotting）测定菌体外膜提取物和 ECP的抗原性。结果显示，提取物有多条不同的条份被两＃11。咖．清所识别，且用活菌制备的血清比死菌的要强得多。所有菌株在不同培养条件下的外膜提取物均具 3 5 kDa条带被鱼血清所识别。所有菌株在不同培养条件－厂的 ECP也均具 3 5 ica条带被鱼血清所识别，卅测 3 5 kDa条俗是l嗜水气单胞菌的共同抗原。经蛋白酶 k处理的 ECP，35k＊。条带消矢，说明这条带是山蛋白质组成的。同时，用＊＊A tL进行了菌株与鱼血清间的交叉反应。罗非鱼注射活菌T4二周及四周后，鱼体内抗休的效价及鱼血清与其它5株菌的交叉反应。活菌注射鱼体内二周及四周时，迄血清。。I。抗活菌＊4抗体的效价分别为1：引2，1：8192，而四周时，抗火活菌的抗体效价为1：1024，负血清与其它5株活菌的交叉反J。V山很w烈多J）’L仲的淌以丫！H从 l：slZ到 1：10240

全文目录

研究的目的  9-10
中文摘要  10-12
英文摘要  12-14
1、文献综述  14-25
  1．1 嗜水气单胞菌的简介  14-16
  1．2 形态与特性  16-17
  1．3 生长条件  17-18
  1．4 致病性  18-21
  1．5 诊断  21-22
  1．6 疫苗开发  22-25
2、材料与方法  25-33
  2．1 细菌分离与培养条件  25-27
    2．1．1 细菌分离  25
    2．1．2 培养基及条件  25
    2．1．3 细菌的特性  25-27
  2．2 细菌各成份的准备  27-29
    2．2．1 全细胞样品的制备  28
    2．2．2 外膜提取物的制备  28
    2．2．3 细菌胞外产物（ECP）制备  28-29
  2．3 ECP中蛋白酶活性的测定  29-30
    2．3．1 平板法测定蛋白酶的活性  29
    2．3．2 底物凝胶电泳法测定蛋白酶的活性  29-30
  2．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  30-31
    2．4．1 染色  30-31
      2．4．1．1 考马斯亮兰染色  30
      2．4．1．2 Schiff's试剂染色  30
      2．4．1．3 银染  30-31
      2．4．1．4 凝集素标记  31
  2．5 罗非鱼抗嗜水气单胞菌抗血清的制备  31
  2．6 间接酶联免疫吸附法（ELISA）  31-32
  2．7 免疫转印（Western blot）  32-33
3、结果  33-50
  3．1 SDS—PAGE电泳蛋白图谱分析  33-34
    3．1．1 全细胞的蛋白图谱  33
    3．1．2 细菌提取物的蛋白图谱  33
    3．1．3 胞外产物（ECP）的蛋白图谱  33-34
  3．2 碳水化合物图谱分析  34-35
    3．2．1 Schiff's染色  34
    3．2．2 银染  34-35
      3．2．2．1 蛋白酶k消化后细菌提取物的银染  34
      3．2．2．2 蛋白酶k消化后细菌ECP的银染  34-35
    3．2．3 凝集素标记  35
  3．3 蛋白酶含量及蛋白酶活性  35
  3．4 ELISA  35-36
  3．5 免疫转印  36-50
4、讨论  50-56
  4．1 SDS-PAGE蛋白图谱  50-51
  4．2 ECP或提取物中的碳水化合物  51-52
  4．3 细菌分泌的蛋白酶  52-54
  4．4 免疫转印  54-56
参考文献  56-66
致谢  66-67
附件  67-72
  附录1 细菌培养基及缓冲液  67-68
  附录2 SDS—PAGE  68-69
  附录3 染色液与脱色液  69
  附录4 底物凝胶电泳  69-71
  附录5 ELISA缓冲液  71-72
  附录6 免疫转印（Western blot）  72

嗜水气单胞菌外膜提取物及胞外产物特性的分析

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