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盐胁迫条件下青杨和旱柳miRNA表达变化研究

作　者: 周婧
导　师: 卓仁英
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: miRNA 小RNA文库青杨旱柳盐胁迫表达
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 267次
引　用: 3次
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内容摘要

土壤盐渍化是当今全球性的资源环境问题和生态问题。世界上100多个国家大约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐渍化,占全球陆地总面积10%。microRNA(miRNA)在植物非生物环境胁迫应答中的作用日益受到重视,研究发现miRNA在抗逆调节中具有重要作用。miRNA是一类长约18-24个碱基的小分子非编码单链RNA,它们广泛存在于真核生物中。在植物中miRNA作为负调控因子,从转录后水平抑制基因表达,从而影响植物器官的发生,发育和适应环境的能力。近年来,人们采用比较基因组学、构建小RNA文库等方法,发现植物miRNA。本研究通过构建青杨小RNA文库,同源序列比对和生物信息学分析及miRNA二级结构分析,鉴定出5个候选miRNA,分别为ptc-miR801,ptc-miR74,ptc-miR102,ptc-miR367,ptc-miR213。这些miRNA通过定量PCR(qRT-PCR)技术和Northern blotting进行进一步分析,证明它们是青杨新miRNA。另外,利用qRT-PCR技术验证其在青杨中的空间表达情况,实验证明,新miRNA在叶中的表达量远远高于茎和根。同时,利用生物信息学技术分析了这5个miRNA靶基因,发现ptc-miR801的靶基因NAC-domain protein,Scarecrow-like(SCL)和ptc-miR213的靶基因MYB4(v-myb avian myeloblastosis oncogene ortholog)都与盐胁迫响应有关。进一步利用qRT-PCR技术分析这两个成熟miRNA在72h盐胁迫(100mmol L-1 NaCl)条件下的表达变化情况。结果显示,ptc-miR801和ptc-miR213均上调表达。基因芯片由于其具高通量,高灵敏性的特点,使得miRNA芯片非常适合检测miRNA表达谱。利用miRNA芯片技术分别将对照组与100mmol L-1 NaCl胁迫处理72小时的青杨(盐敏感植物)和旱柳(耐盐植物)miRNA表达变化情况进行分析,发现盐胁迫后青杨中miRNA表达变化的有161个,其中ppt-miR477a-3p,ppt-miR477a-5p,ppt-miR477h等上调变化量的log值在两倍以上。Ptc-miR474,ptc-miR160等下调变化量的log值在1倍以上。盐胁迫后旱柳中miRNA表达变化有32个,其中ptc-miR474a,ppt-miR894,ptc-miR398b等上调变化量的log值在两倍以上。Ptc-miR164f,ptc-miR1450等下调变化量的log值在1倍以上。另外,利用qRT-PCR技术分别验证了5个青杨miRNA和h4个旱柳miRNA及其它们对应的靶基因在盐胁迫条件下的表达变化情况,实验结果说明盐敏感植物和耐盐植物在miRNA表达模式上有所不同,miR398b和miR474c在青杨中下调表达,但在旱柳中它们均被上调表达。同时,分析了miRNA与其靶基因在不同时间(0、3、6、9、12、48、72小时)的表达变化情况,结果都显示出,在盐敏感树木与耐盐树木中,一些miRNA的表达变化模式不同,miR398b显现出动态变化,但在两种树木中的变化不同; miR396在两种树木中均下调表达; miR474c在青杨中下调表达,在旱柳中上调表达。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章绪论  12-29
  1.1 引言  12-27
    1.1.1 研究背景  12-13
    1.1.2 植物miRNA 特点  13-14
    1.1.3 植物miRNA 产生及作用机制  14-16
    1.1.4 植物miRNA 鉴定检测方法  16-23
      1.1.4.1 构建miRNA 文库  16-18
      1.1.4.2 荧光定量PCR 检测  18-20
      1.1.4.3 miRNA 芯片  20-21
      1.1.4.4 Northern blotting  21
      1.1.4.5 其他方法  21-23
    1.1.5 miRNA 靶基因预测与鉴定  23-24
    1.1.6 植物miRNA 在逆境胁迫应答中的作用  24-26
    1.1.7 杨树及旱柳  26-27
  1.2 研究目标和主要研究内容  27
    1.2.1 关键的科学问题与研究目标  27
    1.2.2 主要研究内容  27
  1.3 研究技术路线  27-29
第二章鉴定青杨新 miRNA  29-49
  2.1 试验材料与研究方法  29-39
    2.1.1 试验材料  29-31
    2.1.2 试验方法  31-39
  2.2 结果与分析  39-48
    2.2.1 试验结果  39-46
    2.2.2 试验分析  46-48
  2.3 小结  48-49
第三章盐胁迫条件下青杨和旱柳 miRNA 表达变化研究  49-63
  3.1 试验材料与方法  49-52
    3.1.1 试验材料  49-50
    3.1.2 试验方法  50-52
  3.2 结果与分析  52-61
    3.2.1 试验结果  52-58
    3.2.2 试验分析  58-61
  3.3 小结  61-63
第四章结论与讨论  63-69
  4.1 结论  63-64
  4.2 讨论  64-66
  4.3 展望  66-69
参考文献  69-81
在读期间的学术研究  81-82
致谢  82

盐胁迫条件下青杨和旱柳miRNA表达变化研究

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