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随机RNA文库技术的建立及其应用

作　者: 刘雪梅
导　师: 沈倍奋；邵宁生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: SELEX 随机RNA文库配基拮抗剂牛凝血酶 gp16。
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术是近年来发展起来的研究核酸结构、功能及进化的一种新的组合化学技术。它在基础医学、临床诊断及药物筛选方面具有广泛的应用前景。本研究的目的是建立并完善随机RNA文库技术，并筛选牛凝血酶和噬菌体末端酶大亚基gp16特异结合的抑制性RNA配基，为新型药物筛选及抗病毒研究提供理论基础及实验依据。本研究利用基因工程方法在大肠杆菌表达并纯化了T7RNA聚合酶，该酶具有很好的体外转录活性。1mg纯化的T7RNA聚合酶相当于250U Promega产品。我们采用全长68nt，随机区由25个碱基构成的RNA文库，筛选获得了与牛凝血酶特异结合的配基。配基高度富集为2条序列，它们与牛凝血酶的亲和力较高，解离常数分别为164nmol／L和240nmol／L。RNA配基能够体外抑制牛凝血酶的催化酶切活性，是作用在牛凝血酶的肝素结合位点上。对其进行结构分析表明，随机区形成的茎环结构是其发挥活性的结构基础。针对配基的基础结构设计并筛选到能够迅速逆转RNA配基生物活性的反义寡核苷酸拮抗剂。在以上研究工作基础上，又筛选了在噬菌体Φ29的基因组DNA组装过程中起重要作用的末端酶大亚基gp16特异结合配基，为抗病毒治疗以及基础研究提供有价值的实验依据。

全文目录

缩略语  4-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-9
前言  9-13
第一部分 T7RNA聚合酶的表达与纯化  13-22
  1.1 实验材料  13
  1.2 实验方法  13-16
  1.3 实验结果  16-19
  1.4 讨论  19-22
第二部分牛凝血酶特异RNA配基的筛选  22-45
  2.1 实验材料  22-24
  2.2 实验方法  24-32
  2.3 实验结果  32-38
  2.4 讨论  38-45
第三部分 RNA配基的结构对其生物活性的影响  45-56
  3.1 实验材料  45-46
  3.2 实验方法  46-47
  3.3 实验结果  47-53
  3.4 讨论  53-56
第四部分抑制双链DNA病毒组装的RNA配基的筛选  56-70
  4.1 实验材料  56
  4.2 实验方法  56-58
  4.3 实验结果  58-68
  4.4 讨论  68-70
总结  70-71
参考文献  71-76
致谢  76-77
附录  77-93
  附录1. 博士期间撰写和发表论文目录  77-91
  附录2. 测序图谱  91-93

随机RNA文库技术的建立及其应用

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