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基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究

作　者: 邹庆
导　师: 汪铭书；程安春
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: FQ-PCR pcDNA-DEV-gC 小鼠动态分布
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 23次
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内容摘要

本论文围绕鸭病毒性肠炎病毒(DEV) gC基因检测方法、DEV gC基因疫苗免疫小鼠后在机体的动态分布开展了下列研究：①检测DEV gC基因的实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法的建立。②将DEV gC基因疫苗(pcDNA-DEV-gC)分别以基因枪轰击法(6μg／只、3μg／只、1μg／只),肌肉注射法(200μg／只、100μg／只、50gg／只),肌肉注射阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC纳米粒和壳聚糖/pcDNA-DEV-gC纳米粒,口服阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC纳米粒和壳聚糖/pcDNA-DEV-gC纳米粒的方法免疫4周龄BALB/c小鼠,免疫后不同时间分别取各组小鼠的免疫部位(皮肤或肌肉)、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、直肠和盲肠等组织器官,用建立的FQ-PCR的方法检测pcDNA-DEV-gC在BALB/C小鼠体内的动态分布。获得如下结果：1.建立的FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,标准曲线扩增效率为100%,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值相关系数达到1.000,具有很好的线性关系,使用方程Y=-3.321X+45.822能够对未知样品进行精确定量(Y=样品Ct值,X=样品拷贝数的对数值),不仅能够用于研究pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的动态分布,而且可以用于DEV的临床快速检测。2. pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的分布规律：各免疫组免疫小鼠1h即可在各组织器官中检测到pcDNA-DEV-gC,基因枪轰击组和肌肉注射组检测到免疫部位含量最高,其次是肝脏、脾脏和胸腺,肌肉注射脂质体和口服脂质体检测到肝脏和脾脏含量最高,肌肉注射壳聚糖和口服壳聚糖检测到十二指肠和直肠含量最高。到18wk时,各免疫组各个组织器官内仍然能够检测到pcDNA-DEV-gC的存在,但多数组织器官中的含量比免疫1h时降低了约102-104。3.不同免疫剂量与分布的关系：不同剂量pcDNA-DEV-gC免疫小鼠各组织中的含量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,200μg组>100μg组>50μg组。在基因枪轰击三个免疫剂量组中,基因疫苗的剂量与基因疫苗在小鼠组织中的含量呈现较弱的正相关性,各剂量之间差异不显著(P>0.05)。在肌肉注射三个免疫剂量组中,基因疫苗的剂量与基因疫苗在小鼠组织中的含量呈现正相关性,1h-3d差异显著(P<0.05),3d-18wk差异不显著(P>0.05)。4.基因枪轰击基因疫苗剂量很小,但在小鼠组织中检测出的含量与肌肉注射相似。脂质体和壳聚糖各有优势,脂质体组检测含量最大的组织是肝脏和脾脏,壳聚糖组检测含量最大的组织是十二指肠和直肠。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
1. 前言  11-27
  1.1 疱疹病毒gC基因的研究进展  11-15
    1.1.1 gC基因的分子生物学特征  11-12
    1.1.2 gC基因编码产物的特性  12
    1.1.3 gC基因影响病毒粒子的稳定性  12-13
    1.1.4 gC基因影响病毒粒子的毒力  13
    1.1.5 gC基因介导病毒吸附  13-15
    1.1.6 gC与C3b结合  15
  1.2 基因疫苗的概述  15-16
  1.3 基因疫苗的研究进展  16-23
    1.3.1 基因疫苗的作用原理  16-18
    1.3.2 基因疫苗的优化策略  18-21
    1.3.3 gC基因与基因疫苗的研究  21-23
  1.4 TaqMan实时荧光定量PCR概述  23-27
    1.4.1 TaqMan FQ-PCR的荧光化学原理  23-24
    1.4.2 TaqMan FQ-PCR的工作原理  24-25
    1.4.3 FQ-PCR技术诊断鸭病毒性肠炎病毒  25-27
2. 材料和方法  27-42
  2.1 菌株、毒株、质粒、载体及佐剂  27
  2.2 实验动物  27
  2.3 实验仪器及软件  27-28
  2.4 主要试剂  28-29
  2.5 主要试剂的配制  29-31
    2.5.1 大肠杆菌培养用试剂  29-30
    2.5.2 质粒提取用试剂  30-31
    2.5.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液  31
    2.5.4 DNA抽提相关溶液  31
  2.6 pcDNA-DEV-gC质粒的大批量制备  31-35
    2.6.1 大肠杆菌DH5a的复壮  31
    2.6.2 pcDNA-DEV-gC质粒小量提取  31-32
    2.6.3 pcDNA-DEV-gC质粒酶切鉴定  32-33
    2.6.4 大肠杆菌DH5a的保存  33
    2.6.5 发酵罐高密度培养大肠杆菌  33
    2.6.6 pcDNA-DEV-gC质粒大量提取  33-35
    2.6.7 质粒含量及纯度测定  35
  2.7 基因枪"子弹"的制备及评价  35-37
    2.7.1 基因枪"子弹"的制备  35-36
    2.7.2 基因枪"子弹"的初步评价  36-37
  2.8 TaqMan FQ-PCR检测pcDNA-DEV-gC方法的建立  37-39
    2.8.1 FQ-PCR引物、探针的设计与合成  37
    2.8.2 FQ-PCR引物合理性的验证  37-38
    2.8.3 FQ-PCR反应条件的优化  38
    2.8.4 FQ-PCR标准曲线的建立  38-39
    2.8.5 FQ-PCR检测方法的敏感性  39
    2.8.6 FQ-PCR检测方法的特异性  39
    2.8.7 FQ-PCR检测方法的重复性  39
  2.9 动物的免疫接种  39-40
  2.10 组织样品的采集和初步处理  40-41
  2.11 FQ-PCR检测质粒pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的分布  41-42
    2.11.1 样品中模板DNA的提取  41
    2.11.2 FQ-PCR检测样品  41-42
3 结果  42-57
  3.1 pcDNA-DEV-gC质粒酶切鉴定  42-43
  3.2 发酵培养和常规培养的菌体湿重  43
  3.3 基因枪"子弹"的初步评价  43-45
  3.4 FQ-PCR检测pcDNA-DEV-gC方法的建立  45-52
    3.4.1 引物合理性的验证  45-47
    3.4.2 引物浓度的优化  47
    3.4.3 探针浓度的优化  47-48
    3.4.4 FQ-PCR标准曲线的建立  48-50
    3.4.5 FQ-PCR检测方法的敏感性  50
    3.4.6 FQ-PCR检测方法的特异性  50-51
    3.4.7 FQ-PCR检测方法的重复性  51-52
  3.5 小鼠免疫后的临床表现  52
  3.6 pcDNA-DEV-gC在免疫小鼠体内各组织中的分布  52-57
    3.6.1 pcDNA-DEV-gC在免疫小鼠体内各组织中不同时间的分布规律  53-54
    3.6.2 pcDNA-DEV-gC不同免疫剂量对免疫小鼠体内分布规律的影响  54
    3.6.3 pcDNA-DEV-gC不同免疫途径对免疫小鼠体内分布规律的影响  54-56
    3.6.4 生理盐水组检测结果  56
    3.6.5 阳性对照组检测结果  56-57
4 讨论  57-67
  4.1 FQ-PCR检测方法的优势  57-58
  4.2 gC基因疫苗在动物体内动态分布规律  58-59
  4.3 不同免疫途径对gC基因疫苗在动物体内动态分布规律的影响  59-63
  4.4 不同免疫剂量对gC基因疫苗在动物体内动态分布规律的影响  63-64
  4.5 基因疫苗不同免疫方式的比较与展望  64-67
5 结论  67-68
参考文献  68-76
致谢  76-77
附录  77-81
攻读学位期间第一作者发表的学术论文  81

基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究

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