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目的:长期以来,软骨缺损一直是临床所面临的难题。传统的治疗方法,如磨削成型术、钻孔微骨折、软骨以及软骨膜移植等,总体疗效不佳。近年来,组织工程学的蓬勃发展为软骨损伤的修复开辟了一条新的途径。选择理想的种子细胞对软骨组织工程至关重要。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有取材方便、体外扩增能力强、多分化潜能好等特点,被认为是最具前途的组织工程种子细胞。然而,MSCs的体外培养及诱导分化还存在许多问题。例如,体外培养操作过程繁琐,容易污染,且细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构,生物学行为受到影响,容易变异。MSCs的定向分化机制、条件还不是很清楚,如何既控制增殖,又能在适当的时候调控MSCs定向分化,还有待进一步研究。骨髓单个核细胞(bone-marrow-derived mononuclear cells,BM-MNCs)包括造血干细胞、MSCs、内皮祖细胞和基质细胞等,是含有多种细胞成分的混合细胞群。研究表明,和骨髓中某种纯化的细胞相比,BM-MNCs可提供细胞之间相互依赖、分化的诱导微环境,分离后直接移植还可避免体外扩增迁移带来的多分化潜能和自动迁移性的下降。因此应用未培养的BM-MNCs作为种子细胞修复软骨缺损,可避免MSCs培养及诱导过程中的诸多问题,理论上具有明显的优越性。本实验旨在探讨未培养的BM-MNCs修复关节软骨缺损的可行性,评价其治疗效果,为今后软骨组织工程的临床应用提供依据。方法:将36只实验兔随机分为3组,每组各12只。实验组均自左股骨远端髓腔抽取骨髓5ml,分离提取自体BM-MNCs。建立兔右膝软骨缺损模型后,实验组植入未培养的自体骨髓单个核细胞-自体纤维蛋白凝胶复合体;实验对照组植入自体纤维蛋白凝胶;空白对照组不行任何植入。分别于术后第8周、12周用空气栓塞法处死动物,每次每组各处死6只,用摆锯锯取右侧股骨滑车部,包括软骨及软骨下的骨组织。对标本进行大体观察、光镜观察包括HE染色和甲苯胺蓝染色、采用SABC法行Ⅱ型胶原的免疫检测,评价修复关节软骨缺损的效果。结果:1大体观察:术后8周,实验组缺损区由乳白色修复组织填充,边界模糊,表面较光滑。实验对照组修复组织色泽浅黄,表面不光整,与周围正常软骨组织间界限清晰。空白对照组缺损区为纤维组织部分填充,仍有较大的空洞。术后12周实验组修复组织表面光滑,与周围软骨色泽相近,间界限模糊不清。实验对照组修复组织表面粗糙,明显凹陷。空白对照组由乳白色修复组织部分填充,仍有明显缺损。2组织学观察:术后8周,实验组标本光镜下可见修复组织表面比较光滑,移植区周围及缺损底部软骨组织开始骨化。修复组织表层细胞形态扁平,向下逐渐移行成为圆形、椭圆形,体积渐增大,出现软骨囊和软骨陷窝。但是与正常软骨相比,修复组织内细胞数目多、细胞形态小、细胞排列紊乱。修复组织厚度大于正常软骨厚度。修复组织甲苯胺蓝异染性明显。实验对照组标本缺损区可见少量纤维组织和大量空泡,修复组织与周围组织的愈合差,缺损区周围软骨有退行性变表现,甲苯胺蓝染色无异染性。空白对照组标本缺损区由薄层纤维组织覆盖,修复组织与周围组织的接合较好,甲苯胺蓝染色无异染性。术后12周,实验组标本修复组织为透明样软骨,细胞数目有所减少,呈现柱状排列趋势,修复组织表面光滑,与周围正常软骨组织结合良好,深层软骨逐渐钙化,与周围的软骨下骨结合良好。甲苯胺蓝染色与周围组织无明显差别。实验对照组标本缺损区由纤维结缔组织填充,表面凹陷、粗糙,与周围组织的愈合不良。修复组织厚度小于正常软骨厚度。修复组织甲苯胺蓝异染性差。空白对照组标本缺损区主要由纤维结缔组织填充,仅缺损周边出现少量软骨,软骨缺损仍部分存在,软骨下骨部分修复。三组评分总体差异有统计学意义(P<0.05)。术后8周、12周时,实验组的组织学评分均优于两对照组(P<0.05);空白对照组的组织学评分均优于实验对照组(P<0.05)。各组12周时的组织学评分均优于6周。3Ⅱ型胶原免疫组化:术后12周,实验组修复组织中细胞呈圆形或椭圆形,呈现柱状排列趋势,细胞质和细胞外间质中Ⅱ型胶原染色呈强阳性,出现大量黄褐色或棕黄色颗粒。实验对照组、空白对照组术后12周时Ⅱ型胶原表达仍呈弱阳性。结论:1在体内的环境下,移植未培养的自体BM-MNCs复合自体纤维凝胶修复关节全层软骨缺损是可行的,修复组织为透明样软骨,修复效果良好。2在体内的环境下,移植不含种子细胞的自体纤维蛋白凝胶不利于关节软骨缺损的修复。
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