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化学发光共振能量转移体系的研究及其在肿瘤细胞内三磷酸腺苷检测中的应用

作　者: 闫亚萌
导　师: 张书圣
学　校: 青岛科技大学
专　业: 有机化学
关键词: 化学发光共振能量转移 DNA 三磷酸腺苷 LumAuNPs CRET-BMBP 肿瘤标志物
分类号: R730.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

化学发光分析法具有很高的灵敏度,且具有仪器设备简单、操作方便、快捷、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点,越来越受到科研工作者的广泛关注。本文研究了荧光素(Fluorescein,F)对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的增强作用,对其反应机理进行了研究,得到Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移体系(CRET)。基于该CRET体系,实现了对DNA的灵敏检测。将该体系进一步用于构建化学发光共振能量转移双螺旋分子信标适体探针,实现了对K562癌细胞和4T1癌细胞中ATP的快速检测,检测结果与HPLC法检测结果具有良好的一致性。本方法灵敏度高,线性范围宽,操作简便,可用于肿瘤标志物的快速、灵敏检测。本文主要开展了以下几个方面的工作:一、Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移增强化学发光体系的研究研究了荧光素(Fluorescein,F)对Luminol-H2O2-HRP化学发光反应体系的增强作用,对其反应机理进行了研究,讨论了Luminol-H2O2-HRP-F增强化学发光体系的动力学性质和荧光光谱性质,研究了荧光素浓度对Luminol-H2O2-HRP化学发光荧光光谱的影响。在此基础上,初步提出了Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移增强化学发光体系。二、利用Luminuol还原HAuCl4法制备LumAuNPs纳米粒子的研究本文利用Luminuol还原HAuCl4法制备了LumAuNPs纳米复合粒子。讨论了反应物的用量对LumAuNPs复合粒子颗粒大小的影响。TEM结果表明,该方法制得的纳米粒子分散性好,粒径均一,且具有良好的化学发光性质。综合LumAuNPs复合粒子的紫外可见、荧光及化学发光性质,确定了Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移体系中制备LumAuNPs复合粒子的最佳反应物的条件为:0.02%的HAuCl4溶液100 mL,0.01 mol/L Luminol溶液1.8 mL。三、基于化学发光共振能量转移体系构建的新型双螺旋分子信标探针用于DNA检测的研究基于Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移体系,构建了化学发光共振能量转移双螺旋分子信标探针(CRET-BMBP)用于DNA的检测。其中,CRET-BMBP检测DNA的线性范围为1.0×10-9 ~ 1.0×10-8 mol·L-1,线性回归方程为y = 11.57679 + 60.09556 x,线性相关系数R = 0.99935,并且我们引入了Au@Fe3O4复合粒子来降低信号背景值改进实验方法,此时,DNA的线性范围为1.0×10-10 ~ 1.0×10-9mol·L-1,线性回归方程为y = 9.69283 + 73.61775 x,线性相关系数R = 0.99975。在此基础上,进一步对该检测方法的选择性进行了研究。四、基于化学发光共振能量转移体系构建的新型分子信标适体探针用于癌细胞中ATP检测的研究基于Luminol-H2O2-HRP-F化学发光共振能量转移体系,构建了化学发光共振能量转移双螺旋分子信标适体探针(CRET-BMBP)用于三磷酸腺苷(ATP)的检测。其中,CRET-BMBP检测ATP线性范围为1.0×10-6 M～1.0×10-5 M,线性回归方程为I = 56.0273 C + 17.4505,检测限为1.1×10-7 M;在此基础上讨论了ATP与适体的反应温度以对ATP检测的影响。将该体系成功地用于K562癌细胞和4T1癌细胞中ATP的快速检测,K562癌细胞中ATP浓度为3.7 (±0.3) mM,4T1癌细胞中ATP浓度为2.4 (±0.3) mM,(n = 3)。检测结果与HPLC法检测结果具有良好的一致性,线性相关系数分别为R = 0.9997 (CRET-BMBP)。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
第一章绪论  14-36
  1. 化学发光分析基本原理  14-18
    1.1 化学发光基本原理  14-15
    1.2 常用的化学发光类物质  15-17
      1.2.1 鲁米诺及异鲁米诺衍生物类  16-17
      1.2.2 吖啶类  17
      1.2.3 过氧草酸酯类  17
    1.3 化学发光共振能量转移基本原理  17-18
    1.4 化学发光的应用及进展  18
  2 DNA 的结构和性质  18-25
    2.1 DNA 的组成  18-19
    2.2 DNA 的化学结构  19-20
    2.3 DNA 的性质  20-21
      2.3.1 DNA 变性  20
      2.3.2 DNA 复性  20-21
      2.3.3 DNA 与小分子的相互作用  21
    2.4 三螺旋脱氧核酸  21-25
      2.4.1 三螺旋 DNA 的稳定性  22-23
      2.4.2 DNA 结构的多态性  23-24
      2.4.3 三螺旋 DNA 的应用  24
      2.4.4 三螺旋脱氧核酸的研究展望  24-25
  3 ATP 的性质及作用  25-27
    3.1 ATP 简介  25
    3.2 ATP 的化学性质  25-26
    3.3 ATP 检测的方法  26-27
  4 化学发光生物传感器  27-35
    4.1 化学发光传感器和生物传感器的设计与发展  27
    4.2 化学发光传感器发展趋势  27-28
    4.3 分子信标  28-30
      4.3.1 分子信标的检测原理  28-29
      4.3.2 分子信标的研究展望  29-30
    4.4 核酸适配体(aptamer) 检测方法  30-33
      4.4.1 SELEX 技术  30
      4.4.2 核酸适配体(aptamer) 的特性  30-31
      4.4.3 核酸适配体(aptamer) 的应用进展  31-33
        4.4.3.1 光学适体传感器  31-32
        4.4.3.2 电化学适体传感器  32-33
    4.5 磁性微球技术  33-35
      4.5.1 磁性微球的制备方法  33-34
        4.5.1.1 包埋法  33
        4.5.1.2 单体聚合法  33
        4.5.1.3 化学转化法  33-34
      4.5.2 磁性微球技术的应用  34-35
        4.5.2.1 细胞分离  34
        4.5.2.2 靶向药物  34
        4.5.2.3 固定化酶  34-35
        4.5.2.4 免疫分析  35
  5 课题意义及主要内容  35-36
第二章荧光素增强 Luminol-H_2O_2-HRP 化学发光体系的研究  36-42
  1 引言  36
  2 实验部分  36-38
    2.1 仪器与试剂  36-37
      2.1.1 仪器装置  36-37
      2.1.2 主要试剂  37
    2.2 实验方法  37-38
      2.2.1 Luminol-H_2O_2-HRP–F 增强化学发光体系的实验方法  37
      2.2.2 Luminol-H_2O_2-HRP–F 化学发光体系荧光光谱性质的实验方法  37-38
  3 结果与讨论  38-41
    3.1 Luminol-H_2O_2-HRP –F 增强化学发光体系的动力学曲线  38
    3.2 Luminol-H_2O_2-HRP –F 增强化学发光体系的荧光光谱性质  38-40
    3.3 Luminol-H_2O_2-HRP –F 增强化学发光体系反应机理的研究  40-41
  4 小结  41-42
第三章 Luminol 还原 HAuCl_4 法制备 Lum AuNPs 复合粒子的研究  42-52
  1 引言  42-43
  2 实验部分  43-44
    2.1 仪器与试剂  43
      2.1.1 仪器装置  43
      2.1.2 主要试剂  43
    2.2 实验方法  43-44
  3 结果与讨论  44-51
    3.1 Luminol 还原 HAuCl_4 法制备 LumAuNPs 复合粒子  44-48
      3.1.1 还原剂 Luminol 的用量对 LumAuNPs 复合粒子粒径的影响  44-45
      3.1.2 氧化剂 HAuCl_4 的用量对 LumAuNPs 复合粒子粒径的影响  45-47
      3.1.3 还原剂的用量对胶体粒径影响的原理  47-48
    3.2 LumAuNPs 复合粒子的表征  48-51
      3.2.1 LumAuNPs 复合粒子胶体的紫外吸收  48-49
      3.2.2 LumAuNPs 复合粒子胶体的荧光吸收  49-51
      3.2.3 LumAuNPs 复合粒子胶体的化学发光性质  51
  4 小结  51-52
第四章基于化学发光共振能量转移的双螺旋分子信标探针检测DNA 的研究  52-62
  1 引言  52-55
  2 实验部分  55-57
    2.1 仪器与试剂  55-56
      2.1.1 仪器装置  55
      2.1.2 主要试剂  55-56
    2.2 实验方法  56-57
      2.2.1 巯基 DNA 与 LumAuNPs 复合粒子的结合  56
      2.2.2 用均相方法检测溶液中靶 DNA  56
      2.2.3 引入 Au@Fe_3O_4 复合粒子检测溶液中靶 DNA  56-57
        2.2.3.1 Au@Fe_3O_4 复合粒子的制备  56-57
        2.2.3.2 引入 Au@Fe_3O_4 复合粒子检测溶液中靶 DNA 的方法  57
  3 结果与讨论  57-60
    3.1 氨基修饰的磁珠包被nanoAu 颗粒前后的 TEM 表征  57-58
    3.2 用均相方法检测溶液中靶 DNA 的标准曲线  58-59
    3.3 利用 Au@Fe_3O_4 复合粒子检测溶液中靶 DNA 的标准曲线  59-60
    3.4 选择性实验  60
  4 小结  60-62
第五章高效液相色谱法检测三磷酸腺苷 ATP 的研究  62-66
  1 引言  62
  2 实验部分  62-63
    2.1 仪器与试剂  62
      2.1.1 仪器装置  62
      2.1.2 主要试剂  62
    2.2 实验方法  62-63
      2.2.1 色谱条件的选择  62-63
      2.2.2 标准曲线的绘制  63
  3 结果与讨论  63-65
  4 小结  65-66
第六章基于化学发光共振能量转移的双螺旋分子信标适体探针检测癌细胞中 ATP 的研究  66-76
  1 引言  66-68
  2 实验部分  68-71
    2.1 仪器与试剂  68-69
      2.1.1 仪器装置  68
      2.1.2 主要试剂  68-69
    2.2 实验过程  69-71
      2.2.1 巯基 DNA 与 LumAuNPs 复合粒子的结合  69
      2.2.2 磁珠的活化  69
      2.2.3 磁珠与氨基修饰 ATP 适体的结合  69-70
      2.2.4 化学发光共振能量转移双螺旋分子信标适体探针的制备  70
      2.2.5 ATP 的检测  70
      2.2.6 癌细胞中三磷酸腺苷 ATP 的提取  70-71
      2.2.7 癌细胞中三磷酸腺苷 ATP 的检测  71
  3 结果与讨论  71-74
    3.1 反应温度的影响  71-72
    3.2 工作曲线的绘制  72-73
    3.3 与液相色谱法测试 ATP 结果比较  73-74
  4 小结  74-76
结论  76-78
参考文献  78-83
致谢  83-84
攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录  84-85

化学发光共振能量转移体系的研究及其在肿瘤细胞内三磷酸腺苷检测中的应用

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