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鸦胆子素D对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的抑制作用

作　者: 刘莉莉
导　师: 陈启建
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 鸦胆子素D 黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗病毒活性荧光定量PCR 间接ELISA
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 22次
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内容摘要

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosic virus, CGMMV)在世界范围内均有分布,主要侵染葫芦科作物,是葫芦科作物的首要病毒病害,给人们带来巨大的经济损失。CGMMV危害严重,防治困难,至今还没有有效的防治手段。鸦胆子素D(Bruceine D)是从中药鸦胆子(Brucea javanica(L.)Merr)种子中提取得到的,已有研究表明,鸦胆子素D对TMV、CMV、PVY均有很好的抑制作用,本实验对鸦胆子素D抗CGMMV进行活性研究。本实验利用感染CGMMV的黄瓜叶片提取出病毒粒子,成功制备了CGMMV的抗血清,间接ELISA检测其效价为1:16,000。利用感染CGMMV的黄瓜叶片提取总RNA,通过RT-PCR得到CGMMV-MP,并成功克隆到pMD18-T载体上,借助原核表达载体pET-29a构建了重组表达质粒pET-29a-MP,DNA序列分析表明,所得MP基因全长为795 bp,与已报告的CGMMV-GX-MP基因的同源性为100%。IPTG诱导6 h后表达量最大,用超声波破碎后检测到融合蛋白以不可溶形式存在。SDS-PAGE检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,间接ELISA检测其效价为1:8,000,western-blot证明抗体特异性良好。在鸦胆子素D抗病毒活性研究中,分别采用半叶法、叶碟法检测了鸦胆子素D对CGMMV侵染和增殖的影响,结果显示,其在10μg/mL的处理浓度下,鸦胆子素D对侵染和增殖的抑制率分别为78.99%和81.05%,另外,在20μg/mL、40μg/mL的浓度下抑制率虽能达到90%,但对寄主植物产生明显的药害,枯斑寄主苋色藜和自然寄主黄瓜的叶片出现了大面积的干枯。通过电镜观察发现鸦胆子素D在体外能够使病毒粒子断裂,采用相对定量PCR试验证明鸦胆子素D能够有效抑制病毒的复制酶基因、运动蛋白基因、外壳蛋白基因的表达,在10μg/mL的处理浓度下对复制酶基因、运动蛋白基因、外壳蛋白基因的抑制率分别为88.77%、92.09%、98.09%。Western-blot,检测结果表明鸦胆子素D对病毒后期运动蛋白、衣壳蛋白的表达也能产生抑制作用。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
1 前言  10-18
  1.1 黄瓜绿斑驳病毒病的研究概况  10-14
    1.1.1 黄瓜绿斑驳病毒病的基因组结构  11-12
    1.1.2 CGMMV 的寄主及传播途径  12
    1.1.3 CGMMV 病害的症状及分类  12-14
  1.2 植物源抗病毒剂的研究概况  14
  1.3 抗病毒活性成分作用机理的研究概况  14-16
    1.3.1 抑制病毒侵染  15
    1.3.2 抑制病毒增殖  15
    1.3.3 作用于传毒介体  15-16
    1.3.4 诱导寄主产生抗病性  16
  1.4 植物源农药的存在问题及发展前景  16-17
  1.5 本研究的目的及意义  17-18
2 材料与方法  18-35
  2.1 实验材料  18-20
    2.1.1 实验仪器  18
    2.1.2 实验药品  18-19
    2.1.3 供试寄主、供试毒源  19
    2.1.4 供试菌株和质粒  19
    2.1.5 实验动物  19
    2.1.6 实验所需引物  19-20
  2.2 实验方法  20-35
    2.2.1 CGMMV 的提纯  20-21
    2.2.2 CGMMV 抗血清的制备及效价测定  21-23
      2.2.2.1 CGMMV 抗血清的制备  21-22
      2.2.2.2 CGMMV 抗血清效价的测定  22
      2.2.2.3 CGMMV 抗体适宜工作浓度测定  22-23
    2.2.3 CGMMV-MP 抗血清的制备及特异性检测  23-30
      2.2.3.1 病叶总RNA 的提取及质量检测  23
      2.2.3.2 目的基因的获得  23-25
      2.2.3.3 克隆载体的获得及检测  25-27
      2.2.3.4 重组表达载体的构建及检测  27-28
      2.2.3.5 融合蛋白的表达与可溶性分析  28-29
      2.2.3.6 融合蛋白抗血清的制备及特异性检测  29-30
    2.2.4 鸦胆子素D 抗CGMMV 活性测定  30-35
      2.2.4.1 对病毒粒体的影响  30
      2.2.4.2 对病毒侵染的影响  30
      2.2.4.3 接种后处理对病毒增殖的影响  30-31
      2.2.4.4 接种前喷施对病毒增殖的影响  31
      2.2.4.5 用药处理不同时间后对病毒增殖的影响  31
      2.2.4.6 接种后不同时间采样处理后对病毒增殖的影响  31
      2.2.4.7 荧光定量PCR 检测对各亚基的影响  31-33
      2.2.4.8 对CGMMV-CP 合成的影响  33-34
      2.2.4.9 对CGMMV-MP 合成的影响  34-35
3 结果与分析  35-52
  3.1 CGMMV 的提纯与抗血清的制备  35-37
    3.1.1 提纯病毒的电镜观察  35
    3.1.2 提纯病毒的浓度  35
    3.1.3 抗血清的效价  35-36
    3.1.4 抗体的适宜工作浓度  36-37
  3.2 CGMMV-MP 抗血清的制备及特异性  37-42
    3.2.1 样品总RNA 的质量  37
    3.2.2 CGMMV-MP 基因的获得  37-38
    3.2.3 CGMMV-MP 基因与克隆载体连接及鉴定  38
    3.2.4 CGMMV-MP 融合表达载体的鉴定及测序结果  38-39
    3.2.5 融合蛋白的分子量预测  39
    3.2.6 融合蛋白的诱导表达  39-40
    3.2.7 融合蛋白的可溶性分析  40
    3.2.8 抗血清的制备及效价测定  40-41
    3.2.9 CGMMV-MP 抗血清的特异性检测  41-42
  3.3 鸦胆子素D 对病毒活性的影响  42-52
    3.3.1 鸦胆子素D 对病毒粒体的影响  42
    3.3.2 对CGMMV 侵染的影响  42
    3.3.3 对CGMMV 增殖的影响  42-50
      3.3.3.1 接种后处理对病毒增殖的影响  42-44
      3.3.3.2 接种前喷药对病毒增殖的影响  44
      3.3.3.3 鸦胆子素D 处理不同时间后对CGMMV 表达情况的影响  44-45
      3.3.3.4 接种CGMMV 不同时间后处理对病毒增殖的影响  45
      3.3.3.5 Real-time PCR 检测对各亚基的影响  45-50
    3.3.4 鸦胆子素 D 对CGMMV 蛋白合成的影响  50-52
      3.3.4.1 对CP 蛋白合成的影响  50-51
      3.3.4.2 对MP 蛋白合成的影响  51-52
4 讨论与总结  52-55
  4.1 CGMMV 的接种  52
  4.2 抗血清的制备  52-53
  4.3 生物活性的测定  53-54
  4.4 总结  54-55
参考文献  55-61
致谢  61

鸦胆子素D对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的抑制作用

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